酒精通過抑制腸上皮干細胞增殖損傷腸上皮的更新修復能力*

王洪巖，徐有青，李 鑫，徐睿玲，郭淑媛，付紅梅，閆朝岐

慢性酒精攝入可引起腸上皮屏障損傷、腸道通透性增加，導致“腸漏”，繼而引起腸源性內毒素血癥和全身系統(tǒng)炎癥，對肝臟造成“二次打擊”，加速酒精性肝病進展[1, 2]。目前，國內外已有研究證實酒精通過不同的機制對腸上皮屏障造成直接的損傷，如酒精可激活Rho/ROCK信號通路，從而影響腸上皮細胞間緊密連接蛋白的分布，導致其結構破壞和腸上皮屏障損傷[3]。酒精可增加miRNA-212過表達，后者通過改變腸上皮細胞間緊密連接蛋白組分ZO-1的表達和分布使腸上皮結構異常，導致“腸漏”的發(fā)生[4]。我們最新研究發(fā)現(xiàn)酒精可引起緊密連接蛋白Occludin發(fā)生細胞內吞，破壞腸上皮細胞間緊密連接結構，導致“腸漏”[5]。腸上皮更新修復的動力主要來源于腸上皮干細胞(intestinal stem cell，ISC)，ISC主要定位在腸隱窩基底部，它不斷增殖、分化為成熟的腸上皮細胞，后者從隱窩基底部不斷向絨毛頂端方向遷移，從而完成腸上皮的更新[6]。正常腸上皮更新修復能力很強，每3～4天更新一次，可在很大程度上彌補酒精導致的腸上皮屏障損傷，可實際并非如此。酒精處理小鼠小腸隱窩基底部增殖細胞數(shù)量明顯減少，推測酒精通過抑制ISC功能，損傷腸上皮更新修復能力。我們制備慢性酒精攝入小鼠模型，采用免疫組化法檢測ISC特異性標志物Lgr5的表達，檢測腸隱窩基底部BrdU陽性細胞數(shù)量，研究酒精對腸上皮細胞增殖的影響，同時動態(tài)觀察了Brdu陽性細胞在腸上皮的遷移情況，結果發(fā)現(xiàn)酒精通過抑制ISC引起腸上皮細胞的增殖和遷移能力下降，從而導致腸上皮的更新修復能力受損。

1 材料與方法

1.1 動物、藥品和試劑 18只C57BL/6小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，雄性，7～8周齡，體質量19～23 g，在SPF級動物實驗室自由進食，室溫為24±2℃，濕度為40%～70%，人工日夜循環(huán)照明。無水乙醇購自北京市通廣精細化工公司(No.32061)；5-溴-2-脫氧脲苷(5-bromo-2′-deoxyuridine, BrdU)購自Sigma試劑公司(B5002)，-20℃保存。大鼠來源抗BrdU抗體(ab6326)、兔來源抗Lgr5(ab75732)、辣根過氧化物酶標記的兔抗大鼠IgG(ab6734)和山羊抗兔IgG(ab6721)均購自Abcam公司。

1.2 慢性酒精性肝損傷小鼠模型的制備 將18只小鼠隨機分為對照組(n=9)和酒精處理組(n=9)。根據(jù)Gao-Binge模型[7]進行改良，即給予含5%酒精的飼料喂養(yǎng)12 w，最后一次給予31.5%高濃度酒精(根據(jù)文獻[7]，將95%酒精6.6 ml與水13.4 ml混合，0.25 g/ml)5 g.kg-1灌胃；對照組9只小鼠正常進食，飲用水中未添加酒精，實驗前一天以生理鹽水灌胃。小鼠禁食8 h，2%戊巴比妥鈉(50 mg.kg-1)腹腔注射麻醉，固定小鼠，剖腹，暴露腹腔，剪取小腸組織(留取近端小腸5 cm)，置于裝有無菌生理鹽水的培養(yǎng)皿中，將5毫升注射器連接灌胃針，清洗腸腔內容物，移入另一個裝有無菌生理鹽水的培養(yǎng)皿，剪成2 cm腸段，置于4%多聚甲醛固定液中。石蠟切片，脫蠟至水，制片。

1.3 腸上皮細胞增殖和遷移能力檢測 在造模成功后取材前，一次性腹腔注射BrdU(50 mg.kg-1)，分別在注射后2 h、24 h和72 h取材，每個時間點取3只小鼠。取小腸組織，石蠟包埋、切片，采用免疫組化法檢測BrdU陽性細胞。以注射BrdU后2 h時每個小腸隱窩BrdU陽性細胞數(shù)反映腸上皮細胞的增殖，動態(tài)觀察三個時間點小腸絨毛最遠端BrdU陽性細胞距小腸隱窩基底部的距離，間接反映腸上皮細胞的遷移程度，使用Image J軟件測量。

1.4 ISC特異性標志物Lgr5表達檢測 采用免疫組化法，取石蠟切片，60℃烤片120 min；標準流程脫蠟、水化，PBST洗3次，每次5 min；加3%過氧化氫阻斷內源性過氧化物酶15～30 min；檸檬酸微波/高壓修復，室溫冷卻；PBST洗3次，每次5 min；加一抗，4℃過夜；用PBST洗3次，每次5 min；加二抗，室溫30 min；PBST洗3次，每次5 min；加DAB顯色，自來水沖洗；蘇木素復染，自來水沖洗；脫水透明，中性樹膠封片。

2 結果

2.1 小腸絨毛形態(tài)結構的變化 在光鏡下，與對照組小鼠比，酒精處理組小鼠小腸絨毛形態(tài)結構大致完整，但小腸絨毛高度明顯縮短、萎縮，絨毛間隙增加(圖1)。

圖1 兩組小鼠小腸絨毛形態(tài)表現(xiàn)酒精處理組小鼠小腸絨毛明顯縮短、萎縮, 絨毛間隙增加(HE，bar=100 μm)

2.2 兩組小鼠腸隱窩Lgr5表達情況比較 酒精處理組ISC特異性標志物Lgr5表達明顯低于對照組(圖2)。

圖2 兩組小鼠腸隱窩ISC特異性標志物Lgr5表達情況(免疫組化, bar=25μm, 箭頭所示為Lgr5陽性的ISC)對照組小鼠腸隱窩基底部可見少量Lgr5陽性表達, 酒精處理組Lgr5表達缺失

2.3 酒精抑制腸上皮細胞的增殖 酒精處理組小鼠每個腸隱窩BrdU陽性細胞數(shù)量為(3.50±0.65)個/腸隱窩，明顯低于對照組的【(7.90±1.08)個/腸隱窩，P<0.05，圖3A】；免疫組化結果顯示對照組小鼠小腸隱窩基底部BrdU陽性細胞數(shù)量較多，顯色清晰，而酒精處理組小鼠小腸隱窩基底部BrdU陽性細胞數(shù)量減少，顯色模糊、融合(圖3B)。

圖3 兩組小鼠腸隱窩BrdU陽性細胞數(shù)量和形態(tài)表現(xiàn)(免疫組化，bar=50μm)A：酒精處理組小鼠腸隱窩BrdU陽性細胞數(shù)顯著下降(*P<0.05)；B：對照組BrdU陽性細胞數(shù)量較多, 結構清晰，而酒精處理組細胞數(shù)量明顯減少，顯色模糊融合

2.4 酒精抑制腸上皮細胞的遷移 在注射BrdU后72 h，對照組小鼠腸上皮細胞從小腸隱窩基底部遷移至絨毛頂端，而酒精處理組小鼠腸上皮細胞的遷移顯著滯后(圖4)。在2 h、24 h和72 h，酒精處理組小鼠小腸絨毛最遠端BrdU陽性細胞距腸隱窩基底部的距離分別為(66.67±1.60)μm、(219.40±12.11)μm和(313.90±9.76)μm，顯著短于對照組【分別為(111.10±1.60)μm、(319.00±10.04)μm和(625.90±3.34)μm，P<0.05】。

圖4 兩組小鼠腸上皮細胞遷移情況比較(免疫組化，bar=50 μm)A：腹腔注射Brdu 2 h、24 h和72 h，酒精處理組小鼠小腸絨毛最遠端BrdU陽性細胞距腸隱窩基底部的距離(即腸上皮細胞的遷移距離)均顯著短于對照組(*P<0.05)；B：兩組小鼠小腸BrdU陽性細胞遷移表現(xiàn)

3 討論

國內外關于酒精對ISC和腸上皮更新修復功能影響的研究甚少。在1987 年，一項研究發(fā)現(xiàn)長期慢性酒精攝入小鼠腸上皮隱窩細胞增殖率明顯低于對照組[8]。隨著ISC特異性標志物(如Lgr5、Bmi1)的發(fā)現(xiàn)[9-11]，關于酒精對ISC影響的研究進入一個新篇章。酒精可以明顯降低小鼠小腸組織和體外培養(yǎng)的小腸來源腸類器官ISC標記蛋白Lgr5的表達，并可抑制體外培養(yǎng)的小腸來源腸類器官的生長，提示酒精能抑制ISC的功能[12]。雖然酒精沒有明顯改變小鼠結腸組織和結腸來源腸類器官Lgr5的表達，但卻可以改變ISC的分化方向，即它降低了ISC向腸上皮吸收細胞分化，而增加ISC向腸內分泌細胞分化，從而影響腸上皮屏障的完整性，導致結腸通透性增高[13]。我們前期的研究也發(fā)現(xiàn)與對照組小鼠相比，酒精處理組小鼠腸隱窩基底部增殖細胞數(shù)量明顯降低。

腸上皮的更新修復動力來源于ISC，它位于腸隱窩內，具有自我更新和增殖分化功能，并受干細胞巢中多種信號通路的調節(jié)。一個腸隱窩內4～6個干細胞中只有一個表現(xiàn)為干細胞功能，其余的處于靜止狀態(tài)，前者可產生多能祖細胞(亦稱短暫增殖細胞)，具有很強的增殖和分化能力，它們每 12～16 小時分裂一次，經過 6 次細胞分裂，即離開隱窩向絨毛方向遷移，逐步分化成腸道另外四種上皮細胞，包括吸收細胞、杯狀細胞、內分泌細胞和潘氏細胞，前三種細胞向腸腔絨毛頂端方向遷移，當?shù)竭_絨毛頂端之后經歷凋亡和脫落，起到腸上皮更新修復的作用[14-16]。本研究顯示，酒精處理組小鼠小腸絨毛形態(tài)結構大致完整，但與對照組相比，酒精處理組小鼠絨毛高度明顯縮短、萎縮，提示酒精損傷了腸上皮的更新修復能力。本研究顯示酒精可以明顯抑制ISC特異性標志物Lgr5的表達，提示酒精可導致ISC數(shù)量或功能的抑制，與Lu R et al[12]研究結果一致。酒精抑制ISC后，如何影響腸上皮的更新修復能力，我們分別檢測了酒精對腸上皮細胞增殖和遷移能力的影響。BrdU為胸腺嘧啶的衍生物，可代替胸腺嘧啶摻入DNA合成，活體注射或加入細胞培養(yǎng)，再采用抗BrdU單克隆抗體進行顯色可顯示增殖細胞[17, 18]。只有增殖活躍有DNA合成的細胞才會摻入BrdU顯色，而腸上皮隱窩是增殖最為活躍的位置。腸上皮細胞3～4天更新一次，腸隱窩基底部細胞會沿著隱窩-絨毛軸向絨毛頂端遷移，直至凋亡脫落，完成腸上皮的更新修復[19, 20]。給小鼠一次性腹腔注射BrdU后，觀察小腸組織BrdU陽性細胞從腸隱窩向絨毛頂端遷移的過程，結果顯示酒精處理組小鼠小腸隱窩基底部BrdU陽性細胞數(shù)量明顯低于對照組小鼠，說明酒精抑制腸上皮細胞的增殖。動態(tài)觀察BrdU陽性細胞的遷移情況發(fā)現(xiàn)，正常小鼠小腸隱窩基底部的BrdU陽性細胞在第3天即可遷移至絨毛頂端，而酒精處理組小鼠腸上皮細胞的遷移明顯滯后。以上結果說明酒精通過抑制ISC功能，導致腸上皮細胞的增殖和遷移能力明顯降低，從而損傷腸上皮的更新修復能力。