患病南美白對(duì)蝦病原的確定與藥物治療效果

唐紅霞 郝爽 張振國(guó) 黃俊嶺 邵鵬 羅璋 馮守明

摘要：2019年7月，天津市某南美白對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）養(yǎng)殖池塘發(fā)生病害，其主要癥狀為體色微紅，空腸空胃，肝胰腺萎縮。為分析病因，通過(guò)寄生蟲和病毒檢測(cè)、病原菌分離鑒定和藥物敏感性測(cè)定等方法對(duì)患病南美白對(duì)蝦及病原進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：從患病南美白對(duì)蝦鰓絲中未發(fā)現(xiàn)大量寄生蟲;傳染性皮下及造血組織壞死病毒、白斑病毒、虹彩病毒和偷死野田村病毒檢測(cè)結(jié)果為陰性，副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）和肝腸胞蟲檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性;肝胰腺中存在大量細(xì)菌，對(duì)優(yōu)勢(shì)菌落進(jìn)行純化并命名為DX-201901，根據(jù)生理生化特征和法國(guó)梅里埃細(xì)菌全自動(dòng)鑒定系統(tǒng)將其鑒定為副溶血弧菌;菌株DX-201901對(duì)鹽酸四環(huán)素、鹽酸土霉素、硫酸鏈霉素和氟苯尼考等4種藥物較為敏感，選擇氟苯尼考為治療藥物，按25.0 mg/kg蝦體重進(jìn)行拌料投喂，每天投喂1次，連續(xù)投喂5 d，取得了較好的治療效果。

關(guān)鍵詞：南美白對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）;副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）;藥物敏感性;治療

南美白對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）因適應(yīng)能力強(qiáng)、生長(zhǎng)速度快、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛養(yǎng)殖，是當(dāng)今世界養(yǎng)殖產(chǎn)量最高的三大蝦類品種之一。然而，近年來(lái)南美白對(duì)蝦病害的頻頻發(fā)生已經(jīng)嚴(yán)重阻礙了該產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）、歐文氏弧菌（Vibrio owensii）、坎貝氏弧菌（Vibrio campbellii）等細(xì)菌性病原[1-4];白斑病毒、桃拉病毒、偷死野田村病毒等病毒性病原[5-6];以及寄生蟲病原，例如肝腸胞蟲（Enterocytozoon hepatopenaei）等相繼被報(bào)道[7]。疾病已成為阻礙南美白對(duì)蝦產(chǎn)業(yè)發(fā)展的最主要因素之一[8]。與所有甲殼動(dòng)物類似，對(duì)蝦沒有獲得性免疫系統(tǒng)，其防御病原感染的途徑主要依靠先天性免疫。因此，目前尚未有針對(duì)南美白對(duì)蝦的疫苗可以使用，這進(jìn)一步增加了南美白對(duì)蝦對(duì)化學(xué)藥物的依賴性。

2019年7月中旬，天津市武清區(qū)某南美白對(duì)蝦養(yǎng)殖池塘發(fā)生疾病，為了盡快進(jìn)行病因分析，以便采取合理措施控制疾病的蔓延，筆者對(duì)病原進(jìn)行了分離，并對(duì)分離純化的疑似病原開展了藥物敏感性試驗(yàn)，利用篩選的藥物進(jìn)行治療，取得了較好的效果。

1材料與方法

1.1南美白對(duì)蝦的發(fā)病情況

在巡塘過(guò)程中，將設(shè)置在池塘中的移動(dòng)料臺(tái)拎出水面進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)有部分蝦存在異常，典型癥狀為蝦體和須微紅，空腸空胃，肝胰腺萎縮，活力差，隨機(jī)統(tǒng)計(jì)100尾蝦，具有患病癥狀蝦的比例為28%。

1.2病原菌的分離和寄生蟲觀察

用75%酒精棉球反復(fù)擦拭患病南美白對(duì)蝦體表后，在無(wú)菌操作臺(tái)中用接種環(huán)從蝦的肝胰腺取少量樣品劃線接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂（LB）平板和硫檸膽蔗瓊脂（TCBS）平板，28 ℃培育24 h后，選優(yōu)勢(shì)菌落進(jìn)行純化獲得純培養(yǎng)DX-201901。同時(shí)，取患病南美白對(duì)蝦的鰓絲、附肢和肝胰腺在顯微鏡下進(jìn)行寄生蟲檢查。

1.3南美白對(duì)蝦病原的檢測(cè)

隨機(jī)取9尾具有典型癥狀的患病蝦，取肝胰腺混合后均分為二份，分別使用DNA和RNA提取試劑盒按照說(shuō)明書提取DNA和RNA，并將RNA反轉(zhuǎn)為cDNA作為模板進(jìn)行病原檢測(cè)。分別用PCR和套式PCR的方法對(duì)副溶血弧菌、傳染性皮下及造血組織壞死病毒、白斑病毒、肝腸胞蟲、虹彩病毒和偷死野田村病毒等6種病原進(jìn)行檢測(cè)，引物序列見表1。PCR反應(yīng)體系為：DNA或cDNA模板1.0 μL， 2×Mix 25 μL，上下游引物各0.5 μL（10 μmol/L），補(bǔ)齊雙蒸水至50 μL。PCR的反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min后進(jìn)行如下循環(huán)，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.4病原菌的鑒定

1.4.1形態(tài)學(xué)觀察將菌株DX-201901分別劃線接種于LB平板和TCBS平板，28 ℃培養(yǎng)24 h后，肉眼觀察其菌落形態(tài)，并挑取少量菌苔進(jìn)行革蘭氏染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察染色特性和菌體形態(tài)。

1.4.2全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀鑒定利用梅里埃VITEK 2 Compact系統(tǒng)，按GN試劑卡片說(shuō)明書操作。

1.5藥物敏感性測(cè)定

1.5.1待測(cè)細(xì)菌的準(zhǔn)備將DX-201901菌株接種在LB培養(yǎng)液中，28 ℃ 150 r/min過(guò)夜培養(yǎng)后，6 000 g，10 min離心收集菌體，無(wú)菌0.75%生理鹽水洗滌一次后，將菌液濃度調(diào)整至1×107 CFU/mL，備用。

1.5.2供試藥物的選擇選擇硫酸新霉素、諾氟殺星、硫酸鏈霉素、鹽酸土霉素、硫酸慶大霉素、鹽酸四環(huán)素、氨芐青霉素、恩諾殺星、硫酸卡那霉素、氟苯尼考等10種藥物進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。

1.5.3最小抑菌濃度（MIC）的測(cè)定參照陳昌福等[9]的方法進(jìn)行。各種藥物用適宜介質(zhì)溶解后，采用2倍稀釋法用0.75%無(wú)菌生理鹽水將各種藥物依次稀釋至1 000.0～0.25 μg/mL等13個(gè)濃度。然后再用LB培養(yǎng)液將各濃度的藥物稀釋10倍，最終，各種藥物的濃度為100.0～0.025 μg/mL等13種。將100.0 μL 1×107 CFU/mL的DX-201901菌液加入到含不同濃度藥物的LB培養(yǎng)基中，28 ℃ 150 r/min培養(yǎng)24 h后，肉眼觀察證實(shí)無(wú)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度，即為該藥物的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentrations，MIC）。

1.6藥物治療試驗(yàn)

將氟苯尼考按25.0 mg/kg南美白對(duì)蝦體重的使用量，與粘合劑混勻后均勻拌在飼料中制備成藥物餌料進(jìn)行投喂，每天投喂1次，連續(xù)投喂5 d。

2結(jié)果

2.1病原菌的分離

取具典型癥狀的南美白對(duì)蝦肝胰腺劃線接種于LB和TCBS平板，都長(zhǎng)出大量形態(tài)單一的菌落，從TCBS平板中取優(yōu)勢(shì)菌落進(jìn)一步純化，分離得到細(xì)菌1株，命名為DX-201901。該菌株在LB平板上28 ℃培養(yǎng)24 h后，形成圓形、濕潤(rùn)、光滑、邊緣整齊中間隆起的淡黃色菌落，在TCBS上形成形態(tài)類似的藍(lán)綠色菌落。

2.2病原菌的鑒定

通過(guò)革蘭氏染色，發(fā)現(xiàn)菌株DX-201901為革蘭陰性短桿菌，無(wú)芽胞，呈弧狀。利用法國(guó)梅里埃公司的全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)鑒定的結(jié)果為副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus），可信度為96%，鑒定評(píng)語(yǔ)為極好的鑒定。具體生化反應(yīng)見表2。

2.3南美白對(duì)蝦的病原檢測(cè)

利用顯微鏡，除在鰓絲中發(fā)現(xiàn)少數(shù)累枝蟲外，未觀察到其他寄生蟲。利用PCR方法對(duì)具有典型癥狀的南美白對(duì)蝦進(jìn)行6種病原的檢測(cè)，結(jié)果顯示：副溶血弧菌和肝腸胞蟲為陽(yáng)性，傳染性皮下及造血組織壞死病毒、白斑病毒、虹彩病毒和偷死野田村病毒為陰性（圖2）。

10種抗菌藥物對(duì)菌株DX-201901的MIC測(cè)定結(jié)果如表3所示。鹽酸土霉素、鹽酸四環(huán)素、硫酸鏈霉素和氟苯尼考具有較好的抑菌效果，最小抑菌濃度分別為3.12、1.56、 1.56和0.78 μg/mL， 其他各種藥物的最小抑菌濃度都≥12.5 μg/mL。

2.5野外治療效果

根據(jù)藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果，采用最小抑菌濃度值較低的氟苯尼考對(duì)患病南美白對(duì)蝦進(jìn)行治療，在投喂3 d后，料臺(tái)中具有典型癥狀的蝦數(shù)量下降，隨機(jī)統(tǒng)計(jì)100尾蝦，具有癥狀的南美白對(duì)蝦比例為12%，連續(xù)用藥5 d后，料臺(tái)中沒有發(fā)現(xiàn)具有典型癥狀的南美白對(duì)蝦，說(shuō)明氟苯尼考對(duì)該疾病具有較好的治療效果。

3討論

據(jù)統(tǒng)計(jì)，2018年因病害給我國(guó)南美白對(duì)蝦養(yǎng)殖造成的直接經(jīng)濟(jì)損失為117.8億元[10]。為了對(duì)疾病進(jìn)行預(yù)防，通常使用微生態(tài)制劑、藻類、免疫增強(qiáng)劑等產(chǎn)品改善養(yǎng)殖水體環(huán)境和調(diào)節(jié)南美白對(duì)蝦的免疫能力，這些措施在南美白對(duì)蝦養(yǎng)殖中發(fā)揮了重要作用。然而，當(dāng)疾病發(fā)生以后，這些措施往往效果不佳，疾病治療仍需以使用藥物為主。按照病原分類，南美白對(duì)蝦的疾病可分為寄生蟲性、病毒性和細(xì)菌性疾病。目前，南美白對(duì)蝦的寄生蟲性病原主要是纖毛蟲類和肝腸胞蟲，本試驗(yàn)中通過(guò)顯微鏡觀察未發(fā)現(xiàn)大量的纖毛蟲，但檢測(cè)到肝腸孢蟲陽(yáng)性。據(jù)報(bào)道，肝腸孢蟲主要是影響南美白對(duì)蝦生長(zhǎng)，感染后表現(xiàn)為生長(zhǎng)速度緩慢，不產(chǎn)生體色發(fā)紅空腸空胃等發(fā)病特征。根據(jù)前期的監(jiān)測(cè)結(jié)果，傳染性皮下及造血組織壞死病毒、白斑病毒、虹彩病毒和偷死野田村病毒等四種病毒是天津地區(qū)南美白對(duì)蝦的常見病毒性病原，但本試驗(yàn)中檢測(cè)結(jié)果均為陰性，因此初步排除了寄生蟲和病毒性疾病的可能。檢測(cè)結(jié)果顯示副溶血弧菌陽(yáng)性，且從南美白對(duì)蝦肝胰腺進(jìn)行病原的分離，發(fā)現(xiàn)TCBS平板上生長(zhǎng)出大量的藍(lán)綠色菌落，經(jīng)鑒定為副溶血弧菌。這暗示著副溶血弧菌可能是引起此次病害的病原。根據(jù)柯赫氏法則，如果需要對(duì)分離的疑似病原進(jìn)行確認(rèn)，應(yīng)該利用分離株對(duì)同類動(dòng)物進(jìn)行回歸感染試驗(yàn)，該項(xiàng)操作通常需要7～15 d。南美白對(duì)蝦具有殘食的特點(diǎn)，發(fā)病個(gè)體由于行動(dòng)遲緩容易被健康個(gè)體殘食，從而導(dǎo)致了病害傳播速度非?？?，這對(duì)生產(chǎn)實(shí)際中如何快速判斷病原提出了更高的要求，所以本試驗(yàn)沒開展回感試驗(yàn);但是，分離到的疑似病原經(jīng)鑒定為副溶血弧菌，該菌是南美白對(duì)蝦的常見病原，引起南美白對(duì)蝦的急性肝胰腺壞死病，主要癥狀為肝胰腺萎縮，體色發(fā)紅[1]，與本次發(fā)病觀察到的癥狀一致。據(jù)此，我們判斷引起此次病害的病原為副溶血弧菌的可能性較大。

為了較好地選擇有效藥物對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物細(xì)菌性疾病進(jìn)行治療，需要對(duì)病原菌進(jìn)行藥物敏感性測(cè)定。較常見的測(cè)定方法有兩種，一種為紙片法，即將帶有一定濃度藥物的紙片粘貼于涂布了待測(cè)菌液的平板上，培養(yǎng)一定時(shí)間后通過(guò)測(cè)定抑菌圈的大小來(lái)判斷敏感程度，該方法操作方便、簡(jiǎn)單，但通常用于定性試驗(yàn)。另一種方法為本試驗(yàn)中使用的最小抑菌濃度（MIC）法，該方法能準(zhǔn)確計(jì)算出藥物對(duì)病原菌的MIC值，因此在生產(chǎn)實(shí)際中較為實(shí)用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，鹽酸四環(huán)素、鹽酸土霉素、硫酸鏈霉素和氟苯尼考對(duì)菌株DX-201901有較好的抑菌效果，而硫酸新霉素、恩諾沙星、硫酸慶大霉素、氨芐青霉素、硫酸卡那霉素和諾氟沙星的抑菌效果比較差。我們選擇了抑菌效果較好的氟苯尼考對(duì)南美白對(duì)蝦進(jìn)行治療，連續(xù)用藥5 d以后，料臺(tái)中已經(jīng)找不到具有典型癥狀的南美白對(duì)蝦，說(shuō)明氟苯尼考對(duì)該疾病具有較好的治療效果。

南美白對(duì)蝦由于養(yǎng)殖利潤(rùn)高而受到養(yǎng)殖者的青睞，據(jù)統(tǒng)計(jì)，天津市50%以上的池塘都在開展南美白對(duì)蝦養(yǎng)殖，但病害的發(fā)生也非常普遍，很多養(yǎng)殖者也因此失去信心。而本試驗(yàn)的研究表明，在準(zhǔn)確判斷病原后，篩選合適的藥物進(jìn)行治療，能起到較好的效果。此外，由于南美白對(duì)蝦病害不易被發(fā)現(xiàn)，且傳播速度快，因此養(yǎng)殖過(guò)程中一定要細(xì)觀察，多巡塘，爭(zhēng)取早發(fā)現(xiàn)早治療，減少經(jīng)濟(jì)損失。

參考文獻(xiàn)：

[1] Lee C T，Chen I，Yang Y，et al.The opportunistic marine pathogen Vibrio parahaemolyticus becomes virulent by acquiring a plasmid that expresses a deadly toxin[J].PNATL ACAD SCI USA，2015，112（34）： 10798-10803.

[2] Kondo H，Van P T，Dang L T，et al.Draft genome sequence ?of non-Vibrio parahaemolyticus acute hepatopancreatic necrosis disease strain ?KC13.17.5，isolated from diseased shrimp in Vietnam[J].Genome Announc，2015，3（5）： e00978-15.

[3] Liu L Y，Xiao J Z，Xia X M， et al.Draft genome sequence of Vibrio owensii strain SH-14，which causes shrimp acute hepatopancreatic necrosis disease[J].Genome Announc，2015，3（6）： e01395-15.

[4] Dong X，Wang H L，Xie G S， et al.An isolate Vibrio campbellii carrying the pir VP gene causes acute hepatopancreatic necrosis disease[J].Emerg Microbes Infect，2017，6（1）： e2.

[5] Walker P J， Mohan CV.Viral disease emergence in shrimp aquaculture： origins，impact and the effectiveness of health management strategies[J].Rev.Aquac，2009 ，2：125-154.

[6] Zhang Q L，Liu Q，Liu S， et al.A new nodavirus is associated with covert mortality disease of shrimp[J].J Gen Virol，2014，95： 2700-2709.

[7] Tangprasittipap A，Srisala J，Chouwdee S，et al.Themicrosporidian Enterocytozoon hepatopenaei is not the cause of white feces syndrome in Whiteleg shrimp Penaeus （Litopenaeus） vannamei[J].BMC Vet Res，2013，9（1）：1-10.

[8] Hsieh S L，Wu C C，Liu C H，et al. Effects of the water extract of Gynura bicolor （Roxb.& Willd.） DC on physiological and immune responses to Vibrio alginolyticus infection in white shrimp （Litopenaeus vannamei） [J].Fish Shellfish Immunol，2013，35：18-25.

[9] 陳昌福，劉遠(yuǎn)高，何廣文，等.克氏原螯蝦暴發(fā)病細(xì)菌性病原的研究[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，28（2）：193-197.

[10] 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁業(yè)漁政管理局，全國(guó)水產(chǎn)技術(shù)推廣總站，中國(guó)水產(chǎn)學(xué)會(huì).我國(guó)水生動(dòng)物重要疫病狀況報(bào)告[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2019：24.

（收稿日期：2020-02-20）

基金項(xiàng)目：天津市水產(chǎn)研究所創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（scyjs201904）;天津市科技計(jì)劃項(xiàng)目（18ZXBFNC00040）;天津市水產(chǎn)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（ITTFR 201708）。

作者簡(jiǎn)介：唐紅霞（1993-），女，碩士研究生，研究方向：水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物病害。E-mail：t1164695014@163.com。

通信作者：馮守明（1965-），男，研究員，研究方向：水產(chǎn)動(dòng)物病害。E-mail：smfeng@163.com。DOI：10.3969/j.issn.1004-6755.2020.04.008