大鯢病毒性疾病最新研究進(jìn)展

張晗 鄧捷 趙虎 孔飛 馬紅英 姜維 張紅星 王啟軍

摘要：中國大鯢（Andrias davidianus）是我國的特有物種，具有極高的產(chǎn)業(yè)開發(fā)價值，但病毒性疾病嚴(yán)重危害大鯢人工養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。本文對大鯢虹彩病毒的分類地位及主要特征、大鯢虹彩病毒病的病理癥狀及診斷防治措施幾個方面進(jìn)行了簡要概述，以期為大鯢病毒性疾病的深入研究提供科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：中國大鯢（Andrias davidianus）;病毒性疾病;診斷防治

中國大鯢（Andrias davidianus），俗稱“娃娃魚”，隸屬兩棲綱（Amphibia）、有尾目（Caudata）、隱鰓鯢科（Cryptobranchidae）。因大鯢具有較高的藥用、食用價值，近年來人工養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大，但疾病亦隨之而來。分析大鯢常見疾病危害程度發(fā)現(xiàn)，病毒性感染對大鯢養(yǎng)殖危害最為嚴(yán)重。目前發(fā)現(xiàn)的感染大鯢的病毒僅大鯢虹彩病毒（Chinese giant salamander iridovirus，GSIV）一種，但其傳播速度快、不易控制且患病大鯢得不到有效治療，死亡率達(dá)90%以上，嚴(yán)重制約大鯢集約化養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展[1-2]。本文從GSIV分類地位及主要特征、大鯢發(fā)病的病理癥狀及其診斷防治措施幾個方面對大鯢病毒性疾病的現(xiàn)狀進(jìn)行概述，以期為后期大鯢病毒性疾病的防治提供堅實的理論依據(jù)，并為大鯢產(chǎn)業(yè)發(fā)展和相關(guān)領(lǐng)域研究提供基本資料和參考。

1GSIV分類地位及主要特性

虹彩病毒科（Iridoviridae）病毒是一類大型的胞漿型雙鏈DNA病毒，該科共包含虹彩病毒屬（Iridovirus）、淋巴囊腫病毒屬（Lymphocystivirus）、腫大細(xì)胞病毒屬（Megalocytivirus）、綠虹彩病毒屬（Chloriridovirus）和蛙病毒屬（Ranavirus）5個屬。雖然不同種屬的虹彩病毒形態(tài)特征相似，但由于宿主類型不同，其自身大小會隨之表現(xiàn)出很大差異。大鯢虹彩病毒（GSIV），亦稱大鯢蛙病毒（Chinese giant salamander ranavirus，GSRV），隸屬于虹彩病毒科蛙病毒屬[3]。

GSIV粒子直徑約150 nm，平面觀察呈六角形，正二十面體對稱結(jié)構(gòu)，外周具囊膜;向內(nèi)依次為對角直徑（150±5）nm（N=30）、厚5 nm的核衣殼及直徑（98±18）nm（N=27）的核心體。成熟的GSIV粒子在受感染細(xì)胞的胞漿內(nèi)呈晶格狀排列或出芽至細(xì)胞外[3]。GSIV經(jīng)熱、酸（pH 3）、堿（pH 10）、有機(jī)溶劑（氯仿、乙醚）及胰蛋白酶處理，囊膜及粒子完整性均被破壞，感染能力大幅下降或完全喪失。經(jīng)反復(fù)凍融處理，GSIV囊膜結(jié)構(gòu)被破壞，但依然具有很強(qiáng)的感染能力[4-5]。

2鯢虹彩病毒病病理癥狀

患病鯢行動呆滯，食欲不振，偶見吐食現(xiàn)象，體表黏液分泌增加。下頜出血，頭、四肢、腹部腫大、有出血斑，背部有突起的白色病灶;嚴(yán)重者白色病灶潰爛，四肢皮膚壞死、肌肉潰爛，甚至斷肢。解剖可見腹腔內(nèi)有大量淡黃色或含血液體，肝腫大、呈灰白色或因淤血呈花斑狀，脾腫大、紫黑色，腎腫大、出血，肺囊充血、出血，腸腔充滿淡黃色或含血液體。光鏡下可觀察到皮膚組織、胃腸道、肝、腎、脾等幾乎全身組織均發(fā)生腫脹、變性、壞死、炎癥細(xì)胞浸潤等病變，部分病變細(xì)胞內(nèi)有圓形或橢圓形嗜酸性病毒包涵體。電鏡下可見肝、腎、脾的細(xì)胞線粒體腫脹、嵴斷裂、溶解，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，核糖體脫落，染色質(zhì)濃縮、邊集，部分細(xì)胞胞漿內(nèi)可見晶格狀排列或散在的病毒粒子[2，6]。

3大鯢虹彩病毒病診斷方法

由于嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）、遲鈍愛德華菌（Edwardsiella tarda）、維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii）等引起的細(xì)菌性感染和GSIV感染大鯢的病理特征有明顯相似性，并且有可能出現(xiàn)部分細(xì)菌與GSIV混合感染的情況，所以患病鯢臨床癥狀、病理解剖結(jié)果可以作為初步診斷GSIV感染的病理學(xué)依據(jù)，除此之外還可采用如下方法進(jìn)一步確診[7-9]。

3.1電鏡檢測

該方法直觀性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高，但操作復(fù)雜，對病毒的檢測存在偶然性，不利于GSIV的快速診斷，且需在較高條件的實驗室完成。

3.2組織培養(yǎng)法

該方法被稱為蛙病毒的“金標(biāo)準(zhǔn)”法，可清晰觀察病毒粒子最基本的理化特征，但操作過程復(fù)雜、要求較高，耗時較長，靈敏度偏低，不利于GSIV的快速診斷。

3.3免疫學(xué)監(jiān)測

例如ELISA檢測、Western blot檢測等，均是依據(jù)抗原、抗體特異性結(jié)合的原理檢測出GSIV，特異性好，靈敏度高，但試驗靈敏性非常依賴抗體質(zhì)量的好壞，且操作復(fù)雜，適合在實驗室檢測研究。

3.4PCR檢測

包括普通PCR、熒光定量PCR、巢式PCR、套式PCR和環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）等。熒光定量PCR檢測特異性更強(qiáng)、靈敏度更高、可重復(fù)、可定量，基于此建立的TaqMan MGB 熒光定量PCR可通過采血檢測的方法實現(xiàn)對活體的疾病監(jiān)測，對大鯢傷害較小[10]。巢式PCR、套式PCR靈敏度較普通PCR高，較熒光定量PCR略低，但成本也低，適合在基層實驗室推廣應(yīng)用[11-12]。LAMP方法在60～65℃的恒溫下即可快速完成目的基因的大量擴(kuò)增，與其他幾種PCR技術(shù)相比，操作快速、高效，無需昂貴儀器設(shè)備，適合基層實驗室和養(yǎng)殖現(xiàn)場的快速檢測[7，13]。

4大鯢虹彩病毒病防治措施

4.1日常預(yù)防措施

4.1.1環(huán)境大鯢生境應(yīng)確保陰涼無風(fēng)，水質(zhì)干凈，水溫10～25 ℃，溶氧量3 mg/L及以上，pH 6.8～8.8。定期換水消毒，確保養(yǎng)殖池潔凈安全。

4.1.2餌料餌料來源應(yīng)確保安全，健康無病害，防止投喂攜帶病毒的餌料。餌料投喂要確保定時、定量、定位、定質(zhì)，并根據(jù)季節(jié)、年齡、水溫、攝食狀況等因素靈活調(diào)整。另可在餌料中添加藥物以增強(qiáng)組織器官抗病毒功能，提高機(jī)體免疫能力[14-15]。

4.1.3日常管理清楚苗種來源，確保苗種不攜帶病毒。建立戶籍檔案和日常生產(chǎn)管理日志，及時掌握大鯢健康狀況。合理控制養(yǎng)殖密度。對發(fā)現(xiàn)患病的大鯢及時做好隔離，未患病大鯢用黃芪多糖、電解多維、葡萄糖連續(xù)7天浸泡，同時進(jìn)行虹彩病毒抽樣PCR檢測。養(yǎng)殖場、養(yǎng)殖水體及養(yǎng)殖用具等用高錳酸鉀和聚維酮碘徹底消毒，餌料魚用高錳酸鉀浸泡消毒，工作人員進(jìn)出患病鯢隔離區(qū)時做好嚴(yán)格消毒，防止疫情擴(kuò)散[8]。

4.2治療方法

由于GSIV引起的病毒性出血癥發(fā)病快、易擴(kuò)散、難治療，易引發(fā)繼發(fā)性感染，目前很難有合適的藥物完全治愈。對虹彩病毒和嗜水氣單胞菌或柱狀黃桿菌（Flavobacterium columnaris）混合感染的大鯢腹腔注射頭孢拉定配合氟苯尼考和維生素C+E浸泡有一定治療效果[8-9]。阿昔洛韋可通過抑制虹彩病毒的胸腺激酶從而降低病毒復(fù)制速度，對虹彩病毒病也有一定治療作用[16-17]。另外，芍藥、人參、黃芪、金銀花、蜂膠等中草藥具有廣譜抗病毒作用，但成分復(fù)雜，特異性差，作用機(jī)理不甚明確，治療方式、用量與效果缺乏穩(wěn)定可靠的數(shù)據(jù)支持，有待進(jìn)一步研究。疫苗具有安全性高、特異性強(qiáng)、作用時間長等優(yōu)點，疫苗免疫被認(rèn)為是預(yù)防水生動物病毒性感染最有效的途徑。賈秋紅等通過自制的GSIV滅活疫苗及中西藥結(jié)合的抗病毒藥物對患病鯢的治療有很好療效;鄧綠洲制備出的GSIV滅活疫苗提高大鯢特異性免疫的同時，非特異性免疫也有所加強(qiáng);孫建濱制備的兩種GSIV滅活疫苗均得到較好的免疫應(yīng)答效果[16，18，19]。這些研究對高效GSIV疫苗新產(chǎn)品的成功研發(fā)和批量化生產(chǎn)有很大幫助。

5討論

目前研究表明，使大鯢患病的病毒僅GSIV一種，屬蛙病毒屬，該屬病毒被稱為“冷血動物殺手”，大多致病性強(qiáng)、免疫原性低，可通過調(diào)控自身和宿主細(xì)胞的基因表達(dá)實現(xiàn)免疫逃逸。蛙屬病毒對不同發(fā)育階段的兩棲動物感染率存在差異，其中，幼體感染占比約60%，成體占比約30%，變態(tài)發(fā)育占比僅10%。當(dāng)幼鯢被GSIV感染后死亡率高達(dá)100%[16]。所以做好大鯢病毒性感染的預(yù)防工作，特別是對幼鯢的預(yù)防保護(hù)極為重要。提高日常防疫質(zhì)量的同時，給幼鯢注射GSIV疫苗是最佳的預(yù)防手段。

疫苗種類的選擇上，滅活疫苗具有安全性高、生產(chǎn)相對簡單等優(yōu)點，得以普遍應(yīng)用;亞單位疫苗可去除病毒粒子中一些引起不良反應(yīng)的成分，安全性更高;核酸疫苗（DNA疫苗和RNA疫苗）等新型疫苗生產(chǎn)成本低、分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，更便于運輸保存，漁用DNA疫苗在1996年首次應(yīng)用以來已得到迅速發(fā)展，曾憲輝等以GSIV 主衣殼蛋白（major capsid protein，MCP）基因構(gòu)建的DNA疫苗誘導(dǎo)大鯢產(chǎn)生了較強(qiáng)的細(xì)胞免疫和體液免疫，在大鯢虹彩病毒病的預(yù)防中具有潛在的應(yīng)用價值[20]。

由此可見，繼續(xù)積極開展大鯢病毒性疾病免疫防控技術(shù)、研發(fā)高效的GSIV疫苗及有效的快速診斷試劑盒，實時監(jiān)測防控，做到早預(yù)防、早發(fā)現(xiàn)、早隔離、早治療，可以有效減少大鯢病毒性疾病發(fā)病率，從而確保大鯢養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

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Research progress on viral disease of Chinese giant salamander

ZHANG Han，DENG Jie，ZHAO Hu，KONG Fei，MA Hongying，

JIANG Wei，ZHANG Hongxing ，WANG Qijun

（Shaanxi Institute of Zoology，Xi，an 710032，China）

Abstract：Chinese giant salamander（Andrias davidianus）is a unique species in China， which has a high value of industrial development.However，viral disease affects the aquaculture of Chinese giant salamander.In order to deeply study and then to conquer viral disease，we summarized the classification status and biological characteristics of Chinese giant salamander iridovirus （GSIV），the pathological symptoms，the main diagnostic methods，and the recent measures for the prevention and treatment of viral disease.

Key words：Chinese giant salamander（Andrias davidianus）;viral disease;prevention and treatment

（收稿日期：2020-03-25）

基金項目：陜西省科學(xué)院重點項目（2015K-03）。

作者簡介：張晗（1990-），女，碩士，研究實習(xí)員，研究方向：水生動物養(yǎng)殖與保護(hù)。E-mail：937528637@qq.com。

通信作者：王啟軍（1983-），男，碩士，副研究員，研究方向：水生動物養(yǎng)殖和保護(hù)。E-mail：wqjab@126.com。DOI：10.3969/j.issn.1004-6755.2020.04.015