黃腐酸鉀與殼寡糖結(jié)合拮抗菌XW5抑制蘋果腐爛病初步探索

張萌欣 薛勝平

摘 要：通過土壤稀釋法篩選出對(duì)蘋果腐爛病有拮抗作用的放線菌，采用平板對(duì)峙法測(cè)定拮抗菌的抑菌活性;測(cè)定黃腐酸鉀和殼寡糖單因素對(duì)蘋果腐爛病的抑制作用;正交實(shí)驗(yàn)測(cè)定放線菌、黃腐酸鉀、殼寡糖復(fù)合后對(duì)蘋果腐爛病的抑制作用。結(jié)果顯示：篩選得到的菌株Z-10為放線菌，對(duì)蘋果腐爛病致病菌的抑制效果良好，抑菌率達(dá)到50.41%;黃腐酸鉀濃度為0.3%時(shí)，抑菌率達(dá)到85.88%;殼寡糖濃度為0.1%時(shí)，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌效果，抑菌率達(dá)到61.25%。黃腐酸鉀、殼寡糖、放線菌稀釋菌液濃度分別為0.3%、0.1%、1.25×10-3mg/mL時(shí)，對(duì)蘋果腐爛病的抑制率達(dá)到77.85%。

關(guān)鍵詞：蘋果腐爛病;放線菌;黃腐酸鉀;殼寡糖;配方

中圖分類號(hào)：S-3 ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

DOI：10.19754/j.nyyjs.20200515006

蘋果腐爛病，是黑腐皮殼屬（Valsa ceratosperma，無性型為殼囊孢屬Cytospora）真菌侵染樹體而引起的一種病害，又稱臭皮病、爛皮病[1]?；疾≥^輕的蘋果樹會(huì)削弱樹勢(shì)，降低蘋果產(chǎn)量，嚴(yán)重的病樹會(huì)導(dǎo)致枯死，毀園。蘋果腐爛病在我國(guó)北部地區(qū)發(fā)生廣泛，已經(jīng)成為危害我國(guó)蘋果產(chǎn)業(yè)的重要病害之一。

目前，防治蘋果腐爛病的方式主要還是化學(xué)防治，但是長(zhǎng)期使用化學(xué)制劑會(huì)使病原菌產(chǎn)生一定的抗藥性，環(huán)境污染和化學(xué)殘留問題也隨之而來。探索生物防治技術(shù)已經(jīng)成為生產(chǎn)上亟待解決的重要課題[2]。微生物防治，是利用有益微生物和微生物代謝產(chǎn)物對(duì)病害進(jìn)行防治，利用2個(gè)生物間進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)和空間的競(jìng)爭(zhēng)，是一種有效的防治技術(shù)。徐路明等人[3]從土壤中分離的放線菌X1菌株能廣譜抑菌，其發(fā)酵液能很好地抑制蘋果腐爛病、蘋果輪紋病和黃瓜枯萎病等多種病菌。薛應(yīng)鈺等人[4]用分離到放線菌菌株ZZ-9的發(fā)酵濾液處理蘋果樹腐爛病病菌，病菌菌絲顏色變深，分支增多，末端膨大畸形，出現(xiàn)原生質(zhì)濃縮，內(nèi)含物釋放的現(xiàn)象，抑菌效果達(dá)到75%。

黃腐酸是腐植酸類物質(zhì)中分子量較小的一個(gè)組分，含活性官能團(tuán)多，生物活性高，水溶性好，能有效促進(jìn)植物生長(zhǎng)。研究表明，黃腐酸能抑制多種植物病害。馬煥普等人[5]實(shí)驗(yàn)中，在葡萄葉上噴施黃腐酸，降低了白腐病的發(fā)病率;許旭旦等人[6]和陳國(guó)參[7]的實(shí)驗(yàn)用黃腐酸處理蘋果腐爛病病斑，發(fā)現(xiàn)能明顯促進(jìn)病斑周圍愈傷組織的生長(zhǎng)，且不會(huì)燒傷活體樹細(xì)胞，干邊率下降，從而增強(qiáng)抵抗腐爛病菌侵入和擴(kuò)展的能力，發(fā)病機(jī)會(huì)減少。

殼寡糖是一種聚合度為2-20的低聚糖，通過殼聚糖降解得到，具有水溶性、廣譜抑菌性，能抑制多種植物病原真菌和細(xì)菌的生長(zhǎng)。胡健等人[8]用殼寡糖處理馬鈴薯環(huán)腐病菌、棉花炭疽病菌、小麥赤霉病菌時(shí)，發(fā)現(xiàn)其能抑制病原菌生長(zhǎng)繁殖及真菌孢子萌發(fā)。臧珉等人[9]用殼寡糖處理棉花枯萎病菌和煙草赤星病菌，發(fā)現(xiàn)其能抑制病原菌菌絲的生長(zhǎng)。

黃腐酸鉀和殼寡糖能有效抑制多種病原真菌生長(zhǎng)，但在施用過程中，自然界中微生物總數(shù)龐大，對(duì)特定植物病害病原菌防治效果難以確定。單獨(dú)使用拮抗菌對(duì)病原菌進(jìn)行防治，不能確定該拮抗菌是否會(huì)成為優(yōu)勢(shì)種群。本研究旨在將拮抗菌與黃腐酸鉀、殼寡糖組合使用，為拮抗菌提供一個(gè)優(yōu)良環(huán)境，可以促進(jìn)拮抗菌成長(zhǎng)為優(yōu)勢(shì)種群，抑制病原菌生長(zhǎng)，同時(shí)誘導(dǎo)植物抗性，減少病害的發(fā)生。

本研究通過篩選出一株對(duì)蘋果腐爛病有拮抗作用的放線菌，初步測(cè)定了與黃腐酸鉀、殼寡糖結(jié)合后對(duì)蘋果腐爛病菌的抑制情況，以期為生物防治的研究提供新思路。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品

河北經(jīng)貿(mào)大學(xué)海棠樹園患有腐爛病的果樹根際土。

1.2 供試病原菌

蘋果腐爛病病原菌來源河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病害流行與綜合防控研究室。

1.3 供試培養(yǎng)基

拮抗菌的分離及保存用高氏一號(hào)培養(yǎng)基，拮抗試驗(yàn)用高氏一號(hào)培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基，拮抗菌液體培養(yǎng)用MH培養(yǎng)基。

1.4 放線菌的分離純化

用20目篩篩去土壤中顆粒較大的土塊及雜質(zhì)，取10g土壤樣品，加入90mL無菌水，震蕩10min，制成10-1土壤懸液，無菌條件下依次稀釋得到10-4、10-5、10-6土壤懸液。吸取10-4、10-5、10-6土壤懸液0.1mL到高氏一號(hào)平板中，涂布均勻，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)平行;將涂布好的平板靜止幾分鐘，放到28℃培養(yǎng)箱內(nèi)倒置培養(yǎng)。培養(yǎng)3d后，根據(jù)不同菌落形態(tài)、氣生菌絲的特點(diǎn)挑選單菌落，再用接種環(huán)將單菌落劃線到高氏一號(hào)平板上，28℃培養(yǎng)7～14d后檢查。將純化3次后的菌株接種到高氏一號(hào)斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)7～14d，于4℃保存。

1.5 放線菌對(duì)蘋果腐爛病抑菌活性的測(cè)定

采用平板對(duì)峙法[10]測(cè)定放線菌株對(duì)蘋果腐爛病的抑菌活性。將高氏一號(hào)培養(yǎng)基和PDA固體培養(yǎng)基融化后按照1∶1的比例倒平板，制成高氏一號(hào)、PDA混合平板。無菌打孔器打制菌餅，將放線菌菌餅放在平板邊緣，28℃培養(yǎng)1～2d后再將蘋果腐爛病菌餅放置于平板中央，置于28℃恒溫培養(yǎng)，計(jì)算抑菌率。計(jì)算公式如下：

抑菌率（100%）=（對(duì)照菌落面積-處理菌落面積）/對(duì)照菌落面積×100%

1.6 黃腐酸鉀單因素對(duì)蘋果腐爛病的抑制作用測(cè)定

稱取黃腐酸鉀溶于水配制系列濃度：3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%，與PDA培養(yǎng)基混合，配制成所需濃度的帶藥培養(yǎng)基;將蘋果腐爛病菌餅放在平板中央，28℃恒溫培養(yǎng)，待空白對(duì)照致病菌長(zhǎng)滿平板時(shí)計(jì)算抑菌率（同上述公式）。

1.7 殼寡糖單因素對(duì)蘋果腐爛病的抑制效果測(cè)定

稱取殼寡糖溶于水配制成0.4%、0.5%、1%、4%、5%的殼寡糖溶液，與PDA培養(yǎng)基混合，配制成所需濃度的帶藥培養(yǎng)基，中間接種致病菌菌餅，28℃恒溫培養(yǎng)。待空白對(duì)照致病菌長(zhǎng)滿平板時(shí)計(jì)算抑菌率（同上述公式）。

1.8 黃腐酸鉀、殼寡糖與放線菌結(jié)合對(duì)腐爛病的抑制作用 ?將篩選得到的放線菌接種到MH培養(yǎng)基中，180r/min，28℃搖床培養(yǎng)，得到放線菌懸液，將菌懸液中菌絲球稀釋得到0.25mg/mL、0.025mg/mL 2個(gè)濃度，制成菌平板最終濃度為1.25×10-2mg/mL、1.25×10-3mg/mL，標(biāo)記為a、b;根據(jù)上述黃腐酸鉀和殼寡糖單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇高低2個(gè)不同濃度結(jié)合制作平板，在平板中央放上蘋果腐爛病菌餅，判斷不同高低濃度結(jié)合在一起對(duì)腐爛病抑制作用。設(shè)計(jì)L4（23）3因素2水平正交實(shí)驗(yàn)（表1）。

2 結(jié)果

2.1 放線菌對(duì)蘋果腐爛病抑制效果

從土壤中共分離得到12株放線菌菌株，其中5株對(duì)蘋果腐爛病表現(xiàn)出拮抗活性，將這5株放線菌命名為Z-2、Z-4、Z-6、Z-E、XW5，具體抑菌數(shù)據(jù)見表2。結(jié)果表明，菌株Z-4、Z-E、XW5對(duì)腐爛病的抑制效果較好，但經(jīng)過血平板培養(yǎng)后，Z-4出現(xiàn)溶血環(huán)，具有細(xì)胞毒性;Z-E、XW5對(duì)蘋果腐爛病的抑菌率達(dá)到46.62%、50.41%，且沒有溶血性，可進(jìn)行后續(xù)的工作實(shí)驗(yàn)。本次實(shí)驗(yàn)選擇Z-10菌株開展后續(xù)工作。

2.2 黃腐酸鉀單因素抑制蘋果腐爛病效果

28℃恒溫培養(yǎng)后，不同濃度黃腐酸鉀對(duì)蘋果腐爛病的抑制作用結(jié)果如表3所示。

從表3可以看出，隨著黃腐酸鉀濃度的增大，對(duì)蘋果腐爛病的抑制作用逐漸增強(qiáng)。0.3%黃腐酸鉀的抑菌率達(dá)到85.88%，當(dāng)黃腐酸鉀濃度達(dá)到0.4%時(shí)，抑菌率突破90%，隨著濃度越來越大，抑菌率也越來越強(qiáng)，0.9%的黃腐酸鉀濃度達(dá)到100%抑菌效果。

2.3 殼寡糖單因素抑制蘋果腐爛病效果

28℃恒溫培養(yǎng)后，不同濃度殼寡糖對(duì)蘋果腐爛病的抑制作用結(jié)果如表4所示

從表4的結(jié)果可以看出，隨著殼寡糖濃度的增高，對(duì)蘋果腐爛病的抑制作用逐漸增強(qiáng)。殼寡糖濃度為0.1%時(shí)，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌效果，達(dá)到61.25%;殼寡糖濃度0.4%時(shí)，對(duì)蘋果腐爛病的抑制率達(dá)到了100%。

2.4 正交試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

不同濃度黃腐酸鉀、殼寡糖和放線菌菌液組合正交結(jié)果如表5所示。

此實(shí)驗(yàn)中，3個(gè)因素對(duì)蘋果腐爛病抑菌率的影響順序?yàn)锳>B>C，最佳組合水平為A2B2C2。根據(jù)方差分析結(jié)果顯示各因素水平之間抑菌率并無顯著性差異。從經(jīng)濟(jì)成本角度來說，低濃度的各因素能夠滿足抑菌要求，所以生產(chǎn)的最佳因素組合為A1B1C1，即黃腐酸鉀濃度0.3%、殼寡糖濃度0.1%、放線菌菌液濃度為1.25×10-3mg/mL。

3 討論

殼寡糖相比于殼聚糖而言，應(yīng)用于植物病害防治及其它各方面更為廣泛。殼聚糖和殼寡糖對(duì)于多種微生物都具有廣譜的抑菌活性，但殼聚糖的分子量較大，粘度高，不溶于水和堿性介質(zhì)，只能溶于酸溶液;殼寡糖分子量小，能夠進(jìn)入細(xì)胞進(jìn)行調(diào)節(jié)，溶于水、無毒無害，所以殼寡糖用來防治蘋果腐爛病是較好的選擇。

黃腐酸作為一種富含高活性的腐植酸，在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用更為廣泛，其不僅包含腐植酸的一般性質(zhì)，更具有分子量小，容易滲透進(jìn)細(xì)胞，使病菌的DNA復(fù)制受到抑制，含活性官能團(tuán)較多，水溶性好等特點(diǎn)，能夠增強(qiáng)作物免疫力，提高抗病能力，所以應(yīng)用更加廣泛[11]。

目前，微生物應(yīng)用于植物病害防治中已經(jīng)十分廣泛，放線菌作為自然界中廣泛存在的微生物，很早就被應(yīng)用到植物病害的防治中。孫現(xiàn)超等[12]分離了一株放線菌JY-22發(fā)酵液對(duì)馬鈴薯干腐病菌絲生長(zhǎng)有很強(qiáng)的抑制作用，對(duì)馬鈴薯干腐病有顯著的抑制作用，達(dá)到74.5%。魏利輝等人[13]公開了一種能夠防治灰霉菌的放線菌菌株及放線菌菌劑，作為一種新型農(nóng)業(yè)殺菌劑，對(duì)灰霉病菌抑制率達(dá)到60%以上。上述2個(gè)放線菌抑菌實(shí)驗(yàn)中都是以放線菌的發(fā)酵液探索病原菌抑制效果，發(fā)酵液中代謝產(chǎn)物對(duì)抑制病原菌起重要作用。本研究從土壤中篩選出一株拮抗放線菌，命名為XW5，并通過平板對(duì)峙法初步測(cè)定了拮抗菌本身對(duì)蘋果腐爛病的抑菌率，抑菌效果達(dá)到50.41%，有很高的利用價(jià)值。黃腐酸和殼寡糖在防治植物病害中也有研究，陳臻等人[14]用黃腐酸處理蘋果腐爛病菌，黃腐酸能夠顯著提高蘋果樹體內(nèi)相關(guān)防御酶系的活性，提高了植物的免疫力，增強(qiáng)了蘋果樹的抗病性;陸陽[15]將殼寡糖與青霉菌組合防治蘋果腐爛病，發(fā)現(xiàn)防治效果明顯高于二者單獨(dú)施用。本實(shí)驗(yàn)將放線菌與黃腐酸鉀、殼寡糖結(jié)合使用抑制蘋果腐爛病，通過單因素實(shí)驗(yàn)選擇不同濃度的黃腐酸鉀、殼寡糖與拮抗放線菌設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)，組合探索蘋果腐爛病抑制效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明黃腐酸鉀濃度0.7%、殼寡糖濃度0.4%、放線菌液10-1抑菌效果較好。從經(jīng)濟(jì)成本角度來說，低濃度的各因素能夠滿足抑菌要求，即黃腐酸鉀濃度黃腐酸鉀濃度0.3%、殼寡糖濃度0.1%、放線菌濃度為1.25×10-3mg/mL便能有效抑制蘋果腐爛病，且抑菌率達(dá)到77.85%。

放線菌應(yīng)用于植物病害防治中已經(jīng)十分廣泛，黃腐酸和殼寡糖也在植物病害的防治中展示出優(yōu)勢(shì)。本次實(shí)驗(yàn)從土壤中分離出一株對(duì)蘋果腐爛病有抑制作用的放線菌，并將其與黃腐酸鉀和殼寡糖結(jié)合使用抑制蘋果腐爛病，在實(shí)驗(yàn)室階段對(duì)其抑制作用進(jìn)行了初步的鑒定，田間防治蘋果腐爛病的效果將待進(jìn)一步研究，以期能為后續(xù)黃腐酸鉀和殼寡糖更好地應(yīng)用于生物防治提供參考。

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（責(zé)任編輯 常陽陽）