海南東寨港紅樹林內(nèi)生真菌Fusarium sp.的含氮代謝產(chǎn)物*

陳曉晴，梁翠芳，林慧美，趙嘉愉，黃楚榆，陶移文

(廣州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 511436)

紅樹林是生長(zhǎng)在熱帶或亞熱帶潮間帶，兼顧海洋和陸地特點(diǎn)的潮灘濕地木本生物群落，其高鹽度、高溫、潮濕、高度微生物和動(dòng)物的競(jìng)爭(zhēng)等極端的環(huán)境條件使其許多內(nèi)生真菌可以產(chǎn)生多種結(jié)構(gòu)獨(dú)特、具有藥理活性的代謝產(chǎn)物[1-2]。鐮刀菌屬是一大類廣泛分布在土壤和植物體內(nèi)的絲狀真菌，能產(chǎn)生豐富多樣的具有抗癌、抗菌、抗氧化等功能的活性次級(jí)代謝產(chǎn)物，如萜類、聚酮類、非核糖體多肽類等[3]，尤以真菌毒素如伏馬毒素、伊快霉素、恩鐮孢菌素、鐮孢菌素、白僵菌素等化合物的活性顯著[4]。前期試驗(yàn)表明，來(lái)源海南省東寨港自然保護(hù)區(qū)紅樹植物的內(nèi)生真菌Fusariumsp. KL11次級(jí)代謝產(chǎn)物具有顯著的抗腫瘤細(xì)胞活性，值得深入研究。本課題組以KL11為出發(fā)菌株，經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)、分離純化和結(jié)構(gòu)解析鑒定，得到6個(gè)含氮類化合物，分別是bassiatin(1)，白僵菌素(2)，葡萄孢鐮菌素(3)，5-甲氧基葡萄孢鐮菌素(4)，8-甲氧基葡萄孢鐮菌素(5)和5，8-二甲氧基葡萄孢鐮菌素(6)(圖1)。

圖1 化合物1～6的結(jié)構(gòu)Fig.1 The structure of compounds 1～6

1 儀器與材料

超凈工作臺(tái)(蘇州蘇潔凈化有限公司，SJ-CJ-2FDQ型)；高壓蒸汽滅菌鍋(日本松下健康醫(yī)療器械株式會(huì)社，MLS-3781L-PC)；搖床(上海紫裕生物)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海霄漢實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司)；薄層色譜硅膠GF254和柱色譜用硅膠(青島海洋化工廠有限公司)；400NB核磁共振波譜儀(日本電子株式會(huì)社)；6460三重四級(jí)桿液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜儀(美國(guó)Agilent公司)；XSCANS單晶衍射儀(美國(guó)Bruker公司)；LC-20A高效液相系統(tǒng)(日本島津株式會(huì)社)；LC-10A高效液相系統(tǒng)(日本島津株式會(huì)社)；SSI二元高效液相系統(tǒng)(美國(guó)LabAlliance公司)；常規(guī)試劑均為分析純。

實(shí)驗(yàn)用菌株KL11采自海南東寨港紅樹林樹葉，菌株分離純化，經(jīng)形態(tài)觀察和基因序列分析，鑒定為Fusariumsp.。該菌種現(xiàn)保存于廣州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院。

2 提取與分離

菌株Fusariumsp. KL11經(jīng)PDA固體培養(yǎng)基復(fù)蘇，GPY(葡萄糖-蛋白胨-酵母膏)液體培養(yǎng)基中放大培養(yǎng)，然后接種于珍珠米固體培養(yǎng)基，常溫靜置培養(yǎng)44 d；發(fā)酵終止，用3倍體積甲醇溶劑浸泡，減壓濃縮，得到粗提濃縮液；濃縮液經(jīng)等體積乙酸乙酯溶劑反復(fù)萃取三次，合并有機(jī)相，減壓濃縮干燥，獲得乙酸乙酯粗提物(134.14 g)；乙酸乙酯粗提物經(jīng)硅膠(200～300目)柱層析分離，依次采用三倍柱體積的φ=100%正己烷(A)、φ=90%正己烷/φ=10%乙酸乙酯(B)、φ=80%正己烷/φ=20%乙酸乙酯(C)、φ=60%正己烷/φ=40%乙酸乙酯(D)、φ=40%正己烷/φ=60%乙酸乙酯(E)、φ=20%正己烷/φ=80%乙酸乙酯(F)、φ=100%乙酸乙酯(G)、φ=80%乙酸乙酯/φ=20%甲醇(H)和φ=100%甲醇(I)進(jìn)行梯度洗脫，獲得9個(gè)不同極性段的組分(A～I(xiàn))；隨后，結(jié)合細(xì)胞活性結(jié)果，對(duì)組分E和F反復(fù)柱層析，凝膠柱層析，薄層層析和反相中壓制備后，得到6個(gè)含氮類化合物。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：白色粉狀固體，分離得到0.094 3 g，ESI-MSm/z: 262.2 [M+H]+，結(jié)合NMR數(shù)據(jù)，推斷其分子式為C15H19NO3，不飽和度為7。詳細(xì)數(shù)據(jù)如下：1H NMR (CDCl3, 400 MHz)δ：7.24 (1H，d，J= 3.9 Hz)，7.23～7.15 (2H，m)，7.02 (1H, t，J= 11.9 Hz)，6.82 (1H，d，J= 8.4 Hz)，5.65 (1H，dd，J= 20.3，8.2 Hz)，4.88～4.68 (1H，m)，3.11～3.02 (3H，m)，1.89 (1H，dt，J= 13.7，6.9 Hz)，0.81 (3H，dd，J= 14.6，8.2 Hz)，0.40～0.29 (3H，m)；13C NMR (CDCl3，101 MHz )δ：170.0，129.6，128.8，127.1，115.9，76.1，34.8，32.0，30.0，18.6，17.1。與文獻(xiàn)[5]數(shù)據(jù)比對(duì)，化合物1鑒定為bassiatin。X-單晶衍射結(jié)果進(jìn)一步確證該化合物結(jié)構(gòu)(圖2)。

圖2 化合物1的晶體結(jié)構(gòu)Fig.2 The crystal structure of compound 1

化合物2：白色方塊狀結(jié)晶，分離得5.133 2 g。ESI-MSm/z: 784.8 [M+H]+，結(jié)合NMR數(shù)據(jù)，推斷其分子式為C45H57N3O9，不飽和度為19。詳細(xì)數(shù)據(jù)如下：1H NMR (DMSO-d6，400 MHz)δ：7.29～7.21 (5H，m)，7.21～7.15 (1H，m)，5.44 (1H，dd，J= 12.2，4.7 Hz)，4.82 (1H，d，J= 9.1 Hz)，3.22～3.12 (2H，m)，3.03 (3H，s)，1.81～1.71 (1H，m)，0.76 (3H，d，J= 6.6 Hz)，0.20 (3H，d，J= 6.8 Hz)；13C NMR (DMSO-d6，101 MHz)δ：169.5，169.3，136.8，128.8，128.4，126.6，74.7，48.7，34.0，31.4，29.6，18.3，16.4。與文獻(xiàn)[6]數(shù)據(jù)比對(duì)，化合物2鑒定為白僵菌素。

化合物3： 紅色粉末狀固體，ESI-MSm/z: 286.4 [M+H]+，結(jié)合 NMR數(shù)據(jù)，推斷其分子式為 C15H11NO5，不飽和度為11。詳細(xì)數(shù)據(jù)如下：1H NMR (CDCl3，400 MHz)δ：13.49 (1H，s)，13.20 (1H，s)，9.50 (1H，s)，7.96(1H，s)，6.76(1H，s)，4.02 (3H，s)，2.80 (3H，s)；13C NMR (CDCl3，101 MHz )δ：186.4，183.9，165.4，161.3，157.9，151.2，143.3，138.7，124.6，118.0，107.9，56.8，25.3。與文獻(xiàn)[7]數(shù)據(jù)比對(duì)，化合物3鑒定為葡萄孢鐮菌素。

化合物4： 紅色粉末狀固體，ESI-MSm/z: 300.4 [M+H]+，結(jié)合NMR數(shù)據(jù)，推斷其分子式為 C16H13NO5，不飽和度為11。詳細(xì)數(shù)據(jù)如下：1H NMR (CDCl3，300 MHz)δ：9.15 (1H，s)，7.85 (1H，s)，7.08 (1H, s)，4.01(3H，s)，3.96 (3H，s)，2.68 (3H，s)；13C NMR (CDCl3，75 MHz)δ：189.2, 178.8, 164.2, 156.6,155.6, 149.2, 148.3, 138.2, 126.2, 117.4, 116.1，111.5, 107.5, 58.0，57.4, 25.2。與文獻(xiàn)[8]數(shù)據(jù)比對(duì)，化合物4鑒定為5-甲氧基葡萄孢鐮菌素。

化合物5： 橙紅色針狀固體，ESI-MSm/z: 300.4 [M+H]+，結(jié)合NMR數(shù)據(jù)，推斷其分子式為 C16H13NO5，不飽和度為11。詳細(xì)數(shù)據(jù)如下：1H NMR (DMSO-d6，400 MHz)δ：9.17 (1H，s)，7.87 (1H，s)，7.19 (1H，s)，4.02 (3H，s)，3.97 (3H，s)，2.68 (3H，s)；13C NMR (DMSO-d6，101 MHz)δ：188.8，178.3，163.5，160.0，155.0，148.5，148.0，137.7，125.6，117.0，115.3，110.0，105.6，56.9，56.7，24.5。與文獻(xiàn)[9]數(shù)據(jù)比對(duì)，化合物5鑒定為8-甲氧基葡萄孢鐮菌素。

化合物6：黃色粉狀固體，ESI-MSm/z: 314.4 [M+H]+，結(jié)合NMR數(shù)據(jù)，推斷其分子式為 C17H15NO5，不飽和度為11。詳細(xì)數(shù)據(jù)如下：1H NMR (CDCl3，400 MHz)δ：9.35 (1H，s)，7.75 (1H，s)，6.85 (1H，s)，4.05 (3H，s)，4.02 (3H，s)，3.95 (3H，s)，2.73 (3H，s)；13C NMR (CDCl3，101 MHz)δ：183.4，181.0，164.1，160.1，158.9，149.4，144.1，139.4，125.5，117.6，115.7，114.3，102.4，61.7，57.0，56.5，25.2。與文獻(xiàn)[10]數(shù)據(jù)比對(duì)，化合物6鑒定為5，8-二甲氧基葡萄孢鐮菌素。

4 結(jié)果和討論

從內(nèi)生真菌Fusariumsp. KL11的發(fā)酵粗提取物中共分離并鑒定6個(gè)含氮化合物，分別是Bassiatin(1)，白僵菌素(2)，葡萄孢鐮菌素(3)，5-甲氧基葡萄孢鐮菌素(4)，8-甲氧基葡萄孢鐮菌素(5)和5，8-二甲氧基葡萄孢鐮菌素(6)。化合物1和2為環(huán)酯肽類化合物，而化合物3，4，5和6為系列葡萄孢鐮菌素類化合物。藥理活性表明，化合物1為血小板聚集抑制劑[5]；化合物2具有良好的抗細(xì)菌[11]、抗真菌[11]、抗病毒[12]和抗腫瘤活性[13-14]，其中抗腫瘤活性尤受關(guān)注。最近文獻(xiàn)報(bào)道[14]，化合物2對(duì)人類視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤Y79、乳腺癌細(xì)胞C6、人肝癌細(xì)胞Hep-G2、單核細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞U-937等40多種細(xì)胞系均呈現(xiàn)出不同程度的細(xì)胞毒性，IC50范圍為0.5～30 μmol/L。作用機(jī)理研究表明[15]，化合物2可以通過抑制NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)、阻斷ERK(extracellular signal-regulated kinase)信號(hào)通路和激活JNK(c-Jun N-terminal kinase)信號(hào)通路，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。因此，化合物2是一種具有潛在抗腫瘤活性的天然化合物；化合物3在體外有強(qiáng)烈抑制結(jié)核桿菌生長(zhǎng)的作用[16]；化合物4，5和6未發(fā)現(xiàn)其明顯的活性[17]。

菌株KL11作為化合物2的高產(chǎn)菌株(產(chǎn)率達(dá)3.8%)，有望通過不同研究戰(zhàn)略(如添加外源性分子底物及設(shè)計(jì)不同類型培養(yǎng)基等手段)，優(yōu)化培養(yǎng)條件，提高化合物2的產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本。同時(shí)，微生物活性代謝產(chǎn)物的發(fā)酵培養(yǎng)，符合綠色經(jīng)濟(jì)環(huán)保、可持續(xù)發(fā)展的理念，可將該菌株作為工程菌進(jìn)行工業(yè)生產(chǎn)，創(chuàng)造巨大的經(jīng)濟(jì)效益。