基于多數(shù)據(jù)庫(kù)分析肝細(xì)胞癌組織FAM49B基因水平及其臨床意義

崔 喆，徐 蘭

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)惡性程度高、進(jìn)展快、易轉(zhuǎn)移、發(fā)病隱匿、預(yù)后差[1-3]。49序列相似的家庭成員B (family with sequence similarity 49 member B，F(xiàn)AM49B)與FAM49A和FAM49C同屬于FAM49基因家族，均包含典型的未知功能結(jié)構(gòu)域1349(domain of unknown function，DUF1349)。FAM49B是定位在染色體8q24、編碼324個(gè)氨基酸、分子量為37 kDa的高度保守蛋白，F(xiàn)AM49B在胰腺導(dǎo)管腺癌中呈低表達(dá)，且能抑制腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲[4]。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于 FAM49B基因與HCC發(fā)病的相關(guān)報(bào)道還不多，其在HCC組織的功能還不清楚。本研究基于大數(shù)據(jù)庫(kù)分析了HCC組織FAM49B表達(dá)的變化及其特征，旨在為HCC患者的病情監(jiān)測(cè)和預(yù)后判斷提供新依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 HCC組織和正常肝組織FAM49B基因水平的比較 在Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)[5]篩選FAM49B基因，設(shè)定條件為:“gene: FAM49B”、“cancer type: liver cancer”、“analysis type：cancer vs. normal analysis”。收集各HCC芯片F(xiàn)AM49B基因水平的差異結(jié)果，并行薈萃分析。在GEPIA[6]中設(shè)定條件為：“gene: FAM49B”、“expression diy:boxplot”、“cancer type：LIHC”，獲得HCC組織和正常組織FAM49B基因水平的差異。

1.2 不同臨床和病理學(xué)特征的HCC組織FAM49B基因水平比較 自TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)下載相關(guān)數(shù)據(jù)。根據(jù)HCC患者FAM49B基因水平，將患者劃分為FAM49B高水平組和低水平組。應(yīng)用SPSS 21.0軟件行x2檢驗(yàn)。

1.3 不同F(xiàn)AM49B基因水平的HCC患者預(yù)后比較 在Kaplan Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)[7]“mRNA RNA-seq”中選擇“l(fā)iver cancer”，檢索“FAM49B”目的基因，按照自動(dòng)選擇最佳截?cái)帱c(diǎn)“auto select best cutoff”進(jìn)行分組，將FAM49B分為高水平組和低水平組，繪制HCC患者的生存曲線。

1.4 FAM49B啟動(dòng)子區(qū)甲基化分析 MethHC數(shù)據(jù)庫(kù)[6]系來(lái)源于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)。利用MethHC[8]平臺(tái)分析FAM49B啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平在正常肝組織與HCC組織中的差異，并應(yīng)用線性回歸分析FAM49B甲基化程度與基因水平的關(guān)系。

1.5 FAM49B相互作用蛋白網(wǎng)絡(luò)分析 在String數(shù)據(jù)庫(kù)[9]，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道、數(shù)據(jù)庫(kù)收錄數(shù)據(jù)和分子間共表達(dá)蛋白相關(guān)性等證據(jù)給出蛋白質(zhì)間存在相互作用的可信度評(píng)分。該分?jǐn)?shù)越接近1，提示分子間存在相互作用的可信度越大，而分?jǐn)?shù)越接近0，說(shuō)明目前的證據(jù)還不足，其可信度較低。在String中搜索蛋白質(zhì)名稱(chēng)“FAM49B”，選擇物種“homo sapiens”，獲取FAM49B相互作用蛋白網(wǎng)絡(luò)。

1.6 基因集富集分析 利用基因集富集分析(gene set enrichment analysis, GSEA)研究FAM49B 基因水平與京都基因和基因組百科全書(shū)(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路基因集的相關(guān)性。設(shè)置隨機(jī)組合次數(shù)為1000次，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)化的富集系數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 HCC組織和正常肝組織FAM49B基因水平的比較 Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果顯示，在Chen Liver et al[10]、Guichard Liver et al[11]、Guichard Liver 2 et al[11]、Mas Liver et al[12]、Roessler Liver et al[13]、Roessler Liver 2 et al[13]、TCGA Liver、Wurmbach Liver et al[14]等8項(xiàng)研究中，HCC組織FAM49B基因較正常肝組織呈顯著高水平(P1=5.68×10-12，P2=9.99×10-14，P3=1.08×10-14，P4=3.75×10-5，P5=2.36×10-5，P6=5.97×10-48，P7=6.61×10-14，P8=4.63×10-5)。薈萃分析這8項(xiàng)研究結(jié)果表明與正常肝組織相比，F(xiàn)AM49B在HCC組織中的基因水平顯著升高(Median Rank=1063.5，P=1.18×10-5，圖1)。利用GEPIA分析TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中的529例樣本，結(jié)果顯示FAM49B在HCC組織(369例)中的基因水平顯著高于正常肝組織(160例，P<0.01,圖2)，與Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)果一致。

2.2 不同臨床和病理學(xué)特征的HCC患者FAM49B基因水平比較 從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中可獲取FAM49B基因水平及361例HCC患者的臨床和病理學(xué)特征數(shù)據(jù)。根據(jù)FAM49B基因水平中位數(shù)將HCC患者分為FAM49B高水平組(n=181例)和低水平組(n=180例)。經(jīng)SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示，不同性別、有無(wú)肝硬化和不同腫瘤分化程度的HCC患者FAM49B基因水平不同，而不同年齡、腫瘤大小、病理學(xué)分期、甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)水平和是否存在脈管侵犯的HCC患者FAM49B基因水平無(wú)顯著差異(P>0.05，表1)。

圖1 Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)中HCC組織與正常肝組織FAM49B 基因水平的比較

圖2 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)529個(gè)樣本FAM49B水平 (紅色為369例HCC，灰色為160例正常肝組織，*P<0.01)

表1 不同臨床和病理學(xué)特征的HCC患者FAM49B基因水平比較(TCGA數(shù)據(jù)庫(kù))

2.3 不同F(xiàn)AM49B基因水平的HCC患者預(yù)后比較 對(duì)Kaplan Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)分析顯示，105例高水平FAM49B患者中位生存時(shí)間為41個(gè)月，而259例低水平患者的中位生存時(shí)間為71個(gè)月，即FAM49B高水平組患者的總體生存期顯著短于低水平組(HR=1.8，P=0.0012)，表現(xiàn)為癌基因特性(圖3)。

圖3 不同F(xiàn)AM49B基因水平的HCC患者預(yù)后比較

2.4 FAM49B啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平分析 利用MethHC分析TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中的HCC病例，結(jié)果顯示FAM49B的轉(zhuǎn)錄模板為NM_001256763，與正常肝組織相比，HCC組織FAM49B啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平顯著降低(P<0.005，圖4A)，其FAM49B啟動(dòng)子區(qū)甲基化程度與基因水平呈負(fù)相關(guān)(P=0，圖4B)。

圖4 FAM49B啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化水平分析 A: 正常肝組織與HCC組織FAM49B啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平比較，**P<0.005；B:HCC組織FAM49B啟動(dòng)子區(qū)甲基化程度與基因水平的關(guān)系

2.5 FAM49B相互作用蛋白網(wǎng)絡(luò) 利用String數(shù)據(jù)庫(kù)分析FAM49B可能存在的蛋白質(zhì)間相互作用，結(jié)果表明，與FAM49B相互作用的Score排名前10的蛋白分別為SERPINA1(Score=0.917)、ISLR(Score=0.905)、FERMT3(Score=0.905)、VEGFB(Score=0.903)、NHLRC2(Score=0.903)、ACTN4(Score=0.903)、A2M(Score=0.902)、SERPINE1(Score=0.902)、SRGN(Score=0.902)和SPARC(Score=0.902，圖5)。

圖5 FAM49B蛋白的相互作用

2.6 FAM49B功能富集分析 GSEA研究結(jié)果顯示，F(xiàn)AM49B mRNA高水平組織富集到細(xì)胞凋亡(NES=1.616，P=0.022，F(xiàn)DR=0.040)、細(xì)胞周期(NES=1.846，P=0.002, FDR=0.023)、調(diào)節(jié)自噬(NES=1.800，P=0.002, FDR=0.023)、P53信號(hào)通路(NES=1.723，P=0, FDR=0.019)等相關(guān)基因集，且其mRNA水平與上述通路中的基因水平呈正相關(guān)(圖6)。

圖6 FAM49B mRNA高水平相關(guān)基因集的富集

3 討論

目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于FAM49B的研究報(bào)道甚少。Chattaragada MS et al[4]報(bào)道FAM49B在胰腺導(dǎo)管腺癌呈低表達(dá)，且通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤線粒體氧化還原反應(yīng)和代謝抑制胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞增殖和侵襲。但FAM49B在HCC發(fā)病過(guò)程中的功能尚不清楚。

本研究對(duì)Oncomine和GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析均顯示HCC組織FAM49B基因水平顯著高于正常肝組織，有力地證實(shí)FAM49B在HCC組織中呈高水平狀態(tài)。在2019年，馬德里國(guó)家心臟病研究中心在JEM雜志上發(fā)表聲明，認(rèn)為男性罹患HCC的風(fēng)險(xiǎn)明顯高于女性。據(jù)統(tǒng)計(jì)，該病的男女發(fā)病之比為7∶1～10∶1左右。主要原因歸于脂肪分泌的一種激素，即脂聯(lián)素在女性體內(nèi)水平較高，可以阻止肝細(xì)胞癌變，而脂聯(lián)素水平降低是男性發(fā)生HCC風(fēng)險(xiǎn)增加的原因[15]。研究表明肝硬化是中國(guó)肝癌患者發(fā)病的主要危險(xiǎn)因素，80%～90%肝癌患者發(fā)生于乙型肝炎肝硬化[16]。細(xì)胞分化程度越低常提示腫瘤的惡性程度越高。研究表明在接受根治性切除的早期HCC患者，低分化組預(yù)后比高分化組差[17]。本研究結(jié)果表明不同性別、有無(wú)肝硬化和不同腫瘤分化程度的HCC患者腫瘤組織FAM49B基因水平顯著不同。本研究結(jié)果顯示FAM49B高水平組HCC患者總體生存期更短，預(yù)后更差，即FAM49B表現(xiàn)為癌基因特性，提示FAM49B有可能成為預(yù)測(cè)HCC患者預(yù)后的候選生物標(biāo)志物。

本研究通過(guò)MethHC平臺(tái)發(fā)現(xiàn)與正常肝組織相比，癌組織FAM49B啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平降低，且FAM49B啟動(dòng)子區(qū)甲基化程度與基因水平呈負(fù)相關(guān)，提示FAM49B啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平降低可能與HCC發(fā)生發(fā)展相關(guān)。王剛等[18]報(bào)道基因體DNA甲基化可能通過(guò)阻斷啟動(dòng)子的啟動(dòng)來(lái)增加轉(zhuǎn)錄活性，可驗(yàn)證本研究發(fā)現(xiàn)的在HCC組織FAM49B啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平降低的結(jié)論。

鋅指RNA結(jié)合蛋白(ZFR)通過(guò)與FAM49B相互作用促進(jìn)結(jié)腸癌和HCC細(xì)胞增殖[19]。研究[20]表明絲氨酸蛋白酶抑制劑A1(SERPINA1)在HCC患者體內(nèi)表達(dá)水平增高，相反SERPINA1突變不會(huì)促進(jìn)HCC的發(fā)生[20]。本研究結(jié)果提示FAM49B可能通過(guò)與SERPINA1蛋白相互作用在HCC發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮功能，與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致。研究FAM49B相互作用蛋白可為FAM49B在HCC發(fā)病中的功能研究提供新線索。

為進(jìn)一步探討FAM49B在HCC發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮作用的可能機(jī)制，本研究利用GSEA預(yù)測(cè)FAM49B在腫瘤發(fā)生調(diào)控中的可能信號(hào)通路是調(diào)節(jié)自噬、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期和P53信號(hào)通路等。自噬是肝細(xì)胞在應(yīng)激狀態(tài)下維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和質(zhì)量控制的重要反應(yīng)。自噬在HCC發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮雙重機(jī)制，即自噬可以抑制HCC的發(fā)生，但也可以作為腫瘤啟動(dòng)子，促進(jìn)HCC的發(fā)展[21]。研究[22]表明細(xì)胞周期調(diào)控是抗癌效應(yīng)的主要標(biāo)志，細(xì)胞周期失調(diào)可誘導(dǎo)癌基因激活及抑癌基因失活，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。細(xì)胞凋亡可維持機(jī)體自身穩(wěn)定，機(jī)體通過(guò)細(xì)胞凋亡消除衰老、損傷或突變的細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞凋亡異常時(shí)，可誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生。P53是重要的抑癌基因，具有調(diào)控細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡及維持基因組穩(wěn)定性等功能，對(duì)預(yù)防腫瘤的發(fā)生具有重要意義。P53發(fā)生突變或缺失可導(dǎo)致HCC的發(fā)生[23]。本研究發(fā)現(xiàn)FAM49B在HCC發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮功能的信號(hào)通路可為HCC發(fā)生機(jī)制研究提供新的線索和思路。

綜上所述，多數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果顯示HCC患者癌組織FAM49B呈高水平，其基因水平與預(yù)后相關(guān)，表現(xiàn)出癌基因特性。它有望成為HCC防治研究的新靶點(diǎn)。本研究可為后續(xù)HCC相關(guān)基礎(chǔ)及臨床研究提供線索。