穩(wěn)定表達(dá)HBx的人肝細(xì)胞系7702的建立*

龐麗君，石 英，郭向華，喬錄新，時紅林，王珊珊，劉 凱

HBVX蛋白(hepatitis B virus X protein，HBx)是由HBV編碼的蛋白之一，基因長度為465 bp，編碼154個氨基酸，是一種潛在的多功能致癌蛋白，在慢性乙型肝炎進(jìn)展為肝硬化和肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)過程中發(fā)揮重要作用[1,2]。長期HBV感染、HBV大量復(fù)制、HBV不同的基因型、HBV DNA與宿主肝細(xì)胞基因組的整合、特定的HBV突變體和HBV編碼的癌蛋白，如HBx和截短的pres2/s蛋白等，都是HBV促進(jìn)HCC發(fā)展的危險因素[3]。雖然HBx基因是HBV基因組中最小的片段，但它是一種多功能的病毒調(diào)節(jié)因子， 通過調(diào)節(jié)細(xì)胞和病毒的轉(zhuǎn)錄活性、蛋白質(zhì)降解、信號傳導(dǎo)途徑等，直接或間接地影響 HBV復(fù)制，并且能調(diào)控細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡，從而在慢性肝炎和肝硬化發(fā)展至腫瘤過程中發(fā)揮作用[4, 5]。HBx作為病毒反式激活因子，通過與腫瘤微環(huán)境中不同組分長期相互作用導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[6]。為了進(jìn)一步探討HBx基因在乙型肝炎相關(guān)HCC發(fā)生發(fā)展過程中的調(diào)控機(jī)制，我們構(gòu)建了HBx表達(dá)質(zhì)粒，選取肝病研究最常用的人正常肝細(xì)胞HL-7702(normal human liver cell 7702，HL-7702)系，在HL-7702細(xì)胞中轉(zhuǎn)染HBx重組質(zhì)粒并篩選出可穩(wěn)定表達(dá)HBx的HL-7702細(xì)胞系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑 表達(dá)HBV的人肝癌細(xì)胞系HepG2.2.15細(xì)胞、人腎上皮細(xì)胞系293細(xì)胞(HEK 293)和人正常肝細(xì)胞系7702(HL-7702)細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。pIRES載體購買于Clontech公司。 T4連接酶、限制性內(nèi)切酶Nhe I和Xho I為Fermentas公司產(chǎn)品。Taq DNA聚合酶、大腸桿菌DH5α、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、DNA marker、蛋白marker等購自北京博邁德基因技術(shù)有限公司。PBS緩沖液、Western blot電泳緩沖液、Western blot電轉(zhuǎn)緩沖液、RIPA蛋白裂解液等購自北京索萊寶科技有限公司。氨芐青霉素、TRIZOL、G418和DMEM培養(yǎng)基為Sigma公司產(chǎn)品，胎牛血清為Gibco公司產(chǎn)品。轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine3000購自Thermo fisher 公司。Western blot和免疫熒光檢測所用抗HBx抗體購自Abcam公司。胰蛋白胨、酵母提取物和瓊脂糖等化學(xué)試劑購自O(shè)XOID公司。

1.2 擴(kuò)增目的基因 采用TRIZOL提取HepG2.2.15細(xì)胞總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，應(yīng)用以下引物擴(kuò)增HBx基因片段。擴(kuò)增引物序列如下，上游引物P1: 5’-CGGGCTAGCATGGCTGCTAGGGTG- 3’，下游引物P2：5’- CCGCTCGAGCTAGGCAGAGGTGAA- 3’，Nhe I內(nèi)切酶識別序列為CGGCTAGCCG， Xho I內(nèi)切酶識別序列為CCCTCGAGGG。PCR反應(yīng)體系如下： 2×PCR mix取 25μl；上游引物P1取 1μl，下游引物P2 取1μl；cDNA模板取2μl，dH2O取 21μl，總體積為50μl。PCR擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，57℃復(fù)性30 s，72℃延伸30 s，共30個循環(huán)。72℃再延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5% 瓊脂糖凝膠電泳鑒定，利用膠回收試劑盒對符合預(yù)期大小的片段進(jìn)行切膠回收。

1.3 構(gòu)建pIRES-HBx表達(dá)載體 利用限制性內(nèi)切酶Nhe I和XhoI，分別對上述PCR產(chǎn)物和載體pIRES (Clontech)進(jìn)行雙酶切，兩者的酶切條件分別為37℃，30 min和37℃，2 h。將上述酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，然后利用切膠回收目的基因和載體片段。用T4 DNA連接酶將酶切后回收的目的基因片段連接到載體pIRES的Nhe I和Xho I酶切位點(diǎn)之間，反應(yīng)體系和反應(yīng)條件如下：T4 DNA連接酶1 μl，5×T4 DNA連接酶緩沖液2μl，載體pIRES 1μl，PCR產(chǎn)物4μl，dH2O 2 μl，總體積為10μl；室溫孵育10 min。然后，取上述連接產(chǎn)物5μl加入DH5α大腸桿菌50μl中進(jìn)行轉(zhuǎn)化，用氨芐青霉素進(jìn)行篩選，次日挑取多個單克隆，37℃過夜搖菌后進(jìn)行小型質(zhì)粒提取，將構(gòu)建的重組質(zhì)粒命名為pIRES-HBx。

1.4 重組質(zhì)粒的鑒定 利用Nhe I和XhoI限制性內(nèi)切酶對提取的多個重組質(zhì)粒pIRES-HBx進(jìn)行Nhe I和Xho I雙酶切，酶切體系和條件如下: pIRES-HBx重組質(zhì)粒1μg, Nhe I和XhoI限制性內(nèi)切酶各1μl,10×酶切緩沖液 2μl, 補(bǔ)dH2O至總體積為20μl。將上述酶切混合物放入37℃水浴鍋孵育30 min。然后，經(jīng)1.5% 瓊脂糖凝膠電泳鑒定插入片段的大小。取片段大小正確的多個重組質(zhì)粒，送到博邁德公司進(jìn)行測序和鑒定，最后選擇測序結(jié)果與原序列一致的重組質(zhì)粒。

1.5 細(xì)胞重組質(zhì)粒表達(dá)檢測 利用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑，將空白載體pIRES和 pIRES-HBx質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至HEK 293細(xì)胞和HL-7702細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，用TRIZOL和 RIPA裂解液提取mRNA和蛋白，分別采用Real-time PCR和Western blot法檢測HBx基因mRNA水平和蛋白表達(dá)情況。

1.6 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的篩選和鑒定 將pIRES對照載體和pIRES-HBx重組質(zhì)粒，分別轉(zhuǎn)染至HL-7702細(xì)胞。待細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，用1 mg/ml G418抗生素篩選細(xì)胞。篩選14 d后，繼續(xù)用0.5 mg/ml G418 DMEM完全培養(yǎng)基維持培養(yǎng)兩個細(xì)胞系1 w。然后，采用免疫熒光技術(shù)檢測HBx蛋白表達(dá)，在熒光顯微鏡下拍照。

2 結(jié)果

2.1 HBx CDS片段擴(kuò)增情況 首先，以HepG2.2.15細(xì)胞cDNA作為模板，用上述引物P1和P2擴(kuò)增HBx基因，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，可見單一條帶，其片段大小與預(yù)期的465 bp一致(圖1)。

1：DNA marker；2：PCR產(chǎn)物圖1 PCR擴(kuò)增獲得的HBx基因片段 利用HepG2.2.15細(xì)胞cDNA和特異性引物擴(kuò)增HBx基因片段，可見單一明亮條帶，大小與目的基因相符

2.2 HEK 293細(xì)胞和HL-7702細(xì)胞HBx mRNA水平檢測情況 將上述擴(kuò)增產(chǎn)物連接至pIRES載體，構(gòu)建過表達(dá)HBx的重組質(zhì)粒pIRES-HBx。經(jīng)雙酶切和測序鑒定，插入載體的DNA片段符合HBx CDS區(qū)大小，測序結(jié)果與HBx CDS序列完全一致。為了進(jìn)一步探討重組載體在細(xì)胞系是否能正常工作，我們選擇了兩個細(xì)胞系HEK 293細(xì)胞和HL-7702細(xì)胞，在這兩個細(xì)胞系中分別轉(zhuǎn)染pIRES載體和pIRES-HBx質(zhì)粒。48 h后，收集細(xì)胞，提取RNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，經(jīng)實(shí)時熒光定量PCR法檢測兩種細(xì)胞HBx mRNA水平，以GAPDH基因作為內(nèi)參，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染pIRES-HBx質(zhì)粒的兩種細(xì)胞HBx mRNA水平均顯著高于對照組細(xì)胞(圖2)。

圖2 熒光定量PCR法檢測細(xì)胞HBx mRNA水平 在HEK 293和 HL-7702細(xì)胞系，分別轉(zhuǎn)染pIRES載體和pIRES-HBx重組質(zhì)粒，48 h后收集細(xì)胞提取RNA并通過熒光定量PCR法檢測，結(jié)果在兩個細(xì)胞系中，轉(zhuǎn)染pIRES-HBx重組質(zhì)粒細(xì)胞HBx mRNA水平顯著高于對照細(xì)胞

2.3 HBx蛋白表達(dá)情況 我們在HEK 293細(xì)胞和HL-7702細(xì)胞，分別轉(zhuǎn)染pIRES載體和pIRES-HBx質(zhì)粒。 48 h后收集細(xì)胞，加RIPA裂解液，提取總蛋白，行蛋白定量后，采用Western blot法檢測HBx蛋白表達(dá)，以β-actin作為蛋白對照。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無論在HEK 293細(xì)胞還是HL-7702細(xì)胞，與轉(zhuǎn)染pIRES載體對照組比，轉(zhuǎn)染pIRES-HBx質(zhì)粒細(xì)胞HBx蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng)(圖3)。我們從mRNA水平和蛋白表達(dá)兩個方面驗(yàn)證了pIRES-HBx質(zhì)粒能夠在轉(zhuǎn)染細(xì)胞過量表達(dá)HBx，可以用于下一步穩(wěn)定篩選細(xì)胞系。

1：HEK 293細(xì)胞轉(zhuǎn)染pIRES； 2：HL-7702 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 pIRES； 3：HEK 293細(xì)胞轉(zhuǎn)染pIRES-HBx； 4：HL-7702細(xì)胞轉(zhuǎn)染pIRES-HBx圖3 免疫印跡法檢測細(xì)胞HBx蛋白表達(dá) 在HEK 293和 HL-7702細(xì)胞，分別轉(zhuǎn)染pIRES載體和pIRES-HBx重組質(zhì)粒，48 h后收取細(xì)胞，裂解，采用Western blot法檢測，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染pIRES-HBx重組質(zhì)粒細(xì)胞HBx蛋白大量表達(dá)

2.4 可穩(wěn)定表達(dá)HBx的人7702細(xì)胞的構(gòu)建與鑒定 首先，在HL-7702細(xì)胞，轉(zhuǎn)染pIRES載體和pIRES-HBx質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染48 h后在培養(yǎng)基里加入高濃度的G418，篩選細(xì)胞，最后用0.5 mg/ml G418 DMEM完全培養(yǎng)基維持培養(yǎng)，篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HBx的HL-7702細(xì)胞系。為了驗(yàn)證穩(wěn)定篩選是否成功，用兔抗人HBx單克隆抗體和免疫熒光技術(shù)檢測HBx蛋白表達(dá)。在轉(zhuǎn)染pIRES-HBx質(zhì)粒的細(xì)胞，可見HBx大量表達(dá)(圖4)，由此證明我們成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)HBx的HL-7702細(xì)胞系，大量擴(kuò)增細(xì)胞后將細(xì)胞凍存于液氮中保存，為后續(xù)對HBx的調(diào)控機(jī)制及其功能研究提供了細(xì)胞基礎(chǔ)。

DAPI: 細(xì)胞核熒光染料；HBx：抗HBx抗體；合并圖像：將DAPI和HBx熒光圖合并圖4 免疫熒光法檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HL-7702細(xì)胞HBx表達(dá) 在HL-7702細(xì)胞，轉(zhuǎn)染pIRES載體和pIRES-HBx重組質(zhì)粒，篩選，采用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染pIRES-HBx重組質(zhì)粒細(xì)胞HBx大量表達(dá)

3 討論

HBV感染可導(dǎo)致一系列肝臟疾病，是人類健康的重大問題之一，每年引起全世界有超過一百萬人死亡[7]。已有研究證明HBx蛋白對HBV的復(fù)制是非常必要的，在細(xì)胞核中HBx與HBV cccDNA和基本轉(zhuǎn)錄機(jī)制相互作用并激活轉(zhuǎn)錄。在細(xì)胞質(zhì)中，HBx通過刺激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路從而促進(jìn)病毒復(fù)制，包括影響細(xì)胞存活、代謝、增殖和轉(zhuǎn)錄途徑[6]。HBx可以與宿主胞內(nèi)多種蛋白相互作用進(jìn)而促進(jìn)HBV的復(fù)制[8,9]。HBx是HBV基因轉(zhuǎn)錄所必需的作用因子，在乙型肝炎病毒致病過程中起重要作用，HBx可直接或間接改變肝臟細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，進(jìn)而引發(fā)肝細(xì)胞的凋亡[10]。HBx還能通過與miRNA的相互作用影響許多腫瘤過程，如增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移、分化和脂肪形成等[11,12]。

HCC是一種具有高致死性的常見惡性腫瘤，大部分HCC的發(fā)生都與慢性HBV感染密切相關(guān)。HBV可以通過多種機(jī)制加速HCC的形成。首先，HBV誘導(dǎo)相應(yīng)的免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)肝臟出現(xiàn)反復(fù)的炎癥反應(yīng)直至纖維化；隨后，HBV可通過DNA整合修飾插入附近的宿主基因，從而導(dǎo)致宿主細(xì)胞基因組不穩(wěn)定并產(chǎn)生致癌融合蛋白[9]。HBV感染后會通過干擾細(xì)胞信號傳導(dǎo)途徑和表觀遺傳學(xué)的調(diào)節(jié)，實(shí)現(xiàn)HBV介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。關(guān)于細(xì)胞凋亡的HBV干擾存在相互矛盾的報(bào)道，其中大部分報(bào)道顯示其抑制凋亡效應(yīng)，但部分研究報(bào)道HBV會誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[13-15]。HBV可表達(dá)多種活性蛋白，尤其是HBx和HBs，它們具有一系列反式激活功能，HBV感染會干擾細(xì)胞凋亡信號傳導(dǎo)，從而促進(jìn)HCC的發(fā)展進(jìn)程和病毒增殖，其中HBx蛋白在細(xì)胞凋亡的干擾中起主要作用。HBx還可以干擾細(xì)胞氧化應(yīng)激和DNA修復(fù)反應(yīng)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞周期進(jìn)展。HBx在HBV相關(guān)的HCC組織經(jīng)常呈高表達(dá)，并通過多種機(jī)制，如調(diào)節(jié)細(xì)胞存活、增殖相關(guān)基因與細(xì)胞內(nèi)蛋白的相互作用和調(diào)節(jié)不同的信號通路等，促進(jìn)HCC的發(fā)生[16-18]。

HBV感染已被公認(rèn)是HCC的主要危險因素，進(jìn)一步的研究也表明HBx是HBV感染后肝癌發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。HBx通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、凋亡、蛋白質(zhì)降解和DNA修復(fù)參與并影響肝癌的發(fā)生[14, 19]。全面了解HBV感染如何誘導(dǎo)和影響HCC的發(fā)生發(fā)展對于開發(fā)更有效的抗病毒治療藥物和預(yù)防肝硬化和HCC的發(fā)生非常重要[20]。因此，為了進(jìn)一步探討HBx在HBV感染和HCC發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中的作用機(jī)制，我們構(gòu)建了HBx過表達(dá)質(zhì)粒，并成功篩選出穩(wěn)定表達(dá)HBx的HL-7702細(xì)胞系，為后續(xù)HBV相關(guān)肝病發(fā)病機(jī)制研究和改進(jìn)臨床療法提供了基礎(chǔ)科研工具。