清肺抑火膠囊鎮(zhèn)咳、祛痰及平喘的藥效學(xué)研究

胡茜 嚴(yán)鈺鋒 林君

[摘要]目的 觀察清肺抑火膠囊鎮(zhèn)咳、祛痰及平喘的作用及其可能機(jī)制。方法 選取清潔級ICR小鼠進(jìn)行鎮(zhèn)咳及祛痰實(shí)驗(yàn)，選取健康豚鼠進(jìn)行平喘實(shí)驗(yàn)，均隨機(jī)分為模型組、清肺抑火膠囊劑量組及苯海拉明組。選用二氧化硫引咳法、酚紅祛痰法、組胺引喘法等模型，觀察清肺抑火膠囊的療效;以葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導(dǎo)A549細(xì)胞炎性因子釋放模型，探討清肺抑火膠囊可能的作用機(jī)制。結(jié)果 清肺抑火膠囊中、高劑量組及苯海拉明組小鼠的咳嗽潛伏期長于模型組和低劑量組，2 min咳嗽次數(shù)少于模型組和低劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;中、高劑量組小鼠的呼吸道酚紅分泌量均高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;中、高劑量組的引喘潛伏期均長于模型組和低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;在DSS誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥模型中，清肺抑火膠囊處理后中、高濃度組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）水平低于DSS模型組和低濃度組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 清肺抑火膠囊具有明顯的鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘作用，其作用機(jī)制可能與抗組胺作用及抑制炎性因子的釋放有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]清肺抑火膠囊;鎮(zhèn)咳;祛痰;平喘;抗炎

[中圖分類號] R978.19? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1674-4721（2020）4（a）-0017-04

[Abstract] Objective To observe the effect of Qingfei Yihuo Capsules in preventing cough， eliminating phlegm and relieving asthma and its possible mechanisms. Methods The clean ICR mice were selected for antitussive and expectorant experiments， and the healthy guinea pigs were selected for antiasthmatic experiments. They were randomly divided into model group， Qingfei Yihuo Capsules doses groups and Diphenhydramine group. The therapeutic effect of Qingfei Yihuo Capsules were observed using models such as the sulfur dioxide induced cough method， the expelling phlegm method with phenol red， and the histamine induced asthma. The possible mechanisms were discussed using the release model of inflammatory factors in A549 cells induced by dextran sulfate sodium salt （DSS）. Results The cough incubation period of the mice in the middle and high dose Qingfei Yihuo Capsules group and Diphenhydramine group were longer than those in the model group and low dose group， the frequency of cough within 2 minutes was fewer than that in the model group and low dose group， the differences were statistically significant （P<0.05）. The secretion of phenol red from trachea in the middle and high dose Qingfei Yihuo Capsules group was higher than that in the model group， the difference was statistically significant （P<0.05）. The incubation period of asthma seizure in the middle and high dose Qingfei Yihuo Capsules group was longer than that in the model group and low dose group， the difference was statistically significant （P<0.05）. In the model of cellular inflammation induced by DSS， the interleukin-1β （IL-1β） levels in cell supernatants in the medium and high concentration groups after using Qingfei Yihuo Capsule were lower than those in the DSS model group and low concentration group， with statistically significant differences （P<0.05）. Conclusion Qingfei Yihuo Capsules has significant effects of preventing cough， eliminating phlegm and relieving asthma， and its possible mechanisms might be related with the anti-histamine effect and the inhibition of the release of inflammatory factors.

[Key words] Qingfei Yihuo Capsules; Preventing cough; Eliminating phlegm; Relieving asthma; Anti-inflammatory

呼吸系統(tǒng)疾病是一種氣管、支氣管、肺等部位的病變，多有咳嗽、痰多、胸痛、氣喘等癥狀，重者呼吸困難、缺氧，甚至呼吸衰竭而致死[1]?！吨袊用駹I養(yǎng)與慢性病狀況報(bào)告（2015年）》指出，目前該疾病在我國慢性病死亡病因中占第3位[2]。大氣顆粒物、吸煙、工業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展導(dǎo)致的理化因子、生物因子吸入以及人口年齡老化等因素，使國內(nèi)外的慢性阻塞性肺疾病、支氣管哮喘及肺部感染等疾病的發(fā)病率、死亡率有增無減[3]。臨床上對伴有炎性反應(yīng)的常見呼吸系統(tǒng)疾病多使用抗菌藥物治療，然而大多該類疾病并非由細(xì)菌感染引起，抗菌藥物對此并無治療效果，反而可導(dǎo)致細(xì)菌耐藥問題[4]。在臨床實(shí)踐中，傳統(tǒng)中醫(yī)藥因可產(chǎn)生良好的抗炎作用而受到廣泛關(guān)注[5-6]。

本研究觀察了清肺抑火膠囊對呼吸系統(tǒng)疾病主要癥狀的藥效學(xué)。該膠囊由清肺抑火湯加減而成[7]，具有清肺止咳、降火生津的功效[8]。實(shí)驗(yàn)證明其對PM2.5所致的大鼠急性肺部損傷也具有一定的緩解作用[9]。然而，經(jīng)現(xiàn)代工藝加工成膠囊后，目前缺少該藥物對呼吸系統(tǒng)疾病的主要癥狀，如鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘等療效的研究，且其發(fā)揮藥效的機(jī)制仍缺乏現(xiàn)代藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)證明。本研究采用二氧化硫刺激引咳法、酚紅祛痰法、藥物引喘法等動物實(shí)驗(yàn)，以及葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium salt，DSS）誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥模型等分別展開實(shí)驗(yàn)，旨在探討清肺抑火膠囊發(fā)揮鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘作用的可能機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1對象與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物

鎮(zhèn)咳及祛痰實(shí)驗(yàn)均采用清潔級ICR小鼠，3月齡，體重35～40 g，雌雄各半;平喘實(shí)驗(yàn)采用健康豚鼠，體重200～300 g，雌雄各半。以上動物均購于上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動物有限公司，許可證號：SCXK（滬）2018-0006。本研究經(jīng)上海健康醫(yī)學(xué)院動物醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2藥物及試劑

清肺抑火膠囊（上海方心制藥科技有限公司，生產(chǎn)批號：20170502），用藥前新鮮配置成低劑量（5 mg/ml）、中劑量（10 mg/ml）及高劑量（20 mg/ml）的混懸液（鎮(zhèn)咳和祛痰實(shí)驗(yàn)），3、6及12 mg/ml的混懸液（平喘實(shí)驗(yàn)）;苯海拉明（遂成藥業(yè)股份有限公司，生產(chǎn)批號：1709251），配置成0.25 mg/ml的藥液;DSS（分子量約50萬，生產(chǎn)廠家：sigmalifescience，生產(chǎn)批號：BCBV7157）。

1.3儀器

全波長EPOCH酶標(biāo)儀（BIOTEK公司）。

1.4模型復(fù)制

1.4.1二氧化硫引咳實(shí)驗(yàn)[10]? 取50 ml燒杯1只，內(nèi)盛0.5 g無水亞硫酸鈉，將盛有50%硫酸的滴定管，置于燒杯上，迅速滴入硫酸5 ml，并立即用鐘罩將燒杯扣住，鐘罩內(nèi)充滿恒定濃度的二氧化硫氣體后，迅速將小鼠放入，觀察和記錄小鼠的咳嗽潛伏期和2 min內(nèi)的咳嗽次數(shù)。

1.4.2酚紅祛痰作用實(shí)驗(yàn)[11]? 實(shí)驗(yàn)前，小鼠饑餓18 h，只供飲水。小鼠按各組劑量灌胃，30 min后按0.2 ml/10 g腹腔注射1%的酚紅溶液，注射后30 min處死，分離氣管，接入注射器并用5% NaHCO3溶液0.8 ml緩慢注入氣管，然后輕輕吸出，如此反復(fù)3次，合并灌洗液，放置10 min使雜質(zhì)沉淀，取透明紅色上液，用酶標(biāo)儀在波長545 nm處，測定其吸光度。

1.4.3組胺引喘實(shí)驗(yàn)[12]? 各組豚鼠連續(xù)給藥灌胃7 d，最后一次灌胃后30 min將豚鼠置于與醫(yī)用超聲霧化器連接的鐘罩內(nèi)，利用霧化器勻速噴入0.2%的磷酸組胺溶液，持續(xù)20 s，記錄豚鼠引喘潛伏期（從噴霧開始到哮喘發(fā)展或抽搐跌倒的時(shí)間）。

1.4.4 DSS細(xì)胞炎癥模型及白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）的含量測定? 將人肺上皮細(xì)胞株A549細(xì)胞（由復(fù)旦大學(xué)病原生物系趙超課題組惠贈）按1×105接種于24孔板中，待細(xì)胞貼壁后，用1% DSS預(yù)處理1 h，然后分別加入經(jīng)0.22 μm除菌濾器過濾的清肺抑火膠囊浸出液，24 h后收集上清，用ELISA法（Human IL-1β ELISA MAXTM Deluxe，Biolegend公司）檢測細(xì)胞因子IL-1β的表達(dá)水平。每個(gè)標(biāo)本做復(fù)孔檢測，取兩次檢測的均值作為最終結(jié)果。

1.5實(shí)驗(yàn)分組及處理

1.5.1清肺抑火膠囊的鎮(zhèn)咳作用和祛痰作用實(shí)驗(yàn)? 將小鼠隨機(jī)分為五組，分別設(shè)為模型組、低劑量組（150 mg/kg）、中劑量組（300 mg/kg）、高劑量組（600 mg/kg）、陽性對照組（苯海拉明7.5 mg/kg）。其中鎮(zhèn)咳實(shí)驗(yàn)每組8只，祛痰實(shí)驗(yàn)每組10只。每只小鼠予以0.3 ml/10 g藥液灌胃，模型組予以0.3 ml/10 g生理鹽水灌胃。

1.5.2清肺抑火膠囊的平喘作用實(shí)驗(yàn)? 將豚鼠隨機(jī)分為五組，每組10只，分別設(shè)為模型組、低劑量組（90 mg/kg）、中劑量組（180 mg/kg）、高劑量組（360 mg/kg）、陽性對照組（苯海拉明4.5 mg/kg）。每只豚鼠每次予以3 ml/100 g藥液灌胃，模型組予以3 ml/100 g生理鹽水灌胃。

1.5.3 DSS細(xì)胞炎癥模型? 按照清肺抑火膠囊浸出液處理細(xì)胞的終濃度分組，分別為低濃度組（1 μg/ml）、中濃度組（2 μg/ml）、高濃度組（4 μg/ml）。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Graphpad Prism 6.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，并采用Bonferroni法進(jìn)行組間的兩兩比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1各組小鼠咳嗽潛伏期及2 min咳嗽次數(shù)的比較

低劑量組小鼠的咳嗽潛伏期及2 min咳嗽次數(shù)與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;中、高劑量組及苯海拉明組小鼠的咳嗽潛伏期長于模型組和低劑量組，2 min咳嗽次數(shù)少于模型組和低劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;中劑量組與高劑量組小鼠的咳嗽潛伏期及2 min咳嗽次數(shù)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;苯海拉明組與中、高劑量組小鼠的咳嗽潛伏期及2 min咳嗽次數(shù)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（表1）。

與模型組比較，*P<0.05;與模型組比較，**P<0.01;與低劑量組比較，##P<0.01;“-”表示無

2.2各組小鼠呼吸道酚紅分泌量的比較

低劑量組小鼠的呼吸道酚紅分泌量與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;中、高劑量組小鼠的呼吸道酚紅分泌量均高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;低、中、高劑量組小鼠的呼吸道酚紅分泌量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;苯海拉明組小鼠的呼吸道酚紅分泌量高于模型組及低、中、高劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）（圖1）。

與模型組比較，*P<0.05;與模型組比較，**P<0.01;與低劑量組比較，##P<0.01;與中劑量組比較，&&P<0.01;與高劑量組比較，$$P<0.01

2.3各組豚鼠引喘潛伏期的比較

低劑量組豚鼠的引喘潛伏期與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;中、高劑量組的引喘潛伏期均長于模型組和低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;高劑量組的引喘潛伏期長于中劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;苯海拉明組的引喘潛伏期長于模型組及低、中劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;苯海拉明組的引喘潛伏期與高劑量組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（圖2）。

與模型組比較，**P<0.01;與低劑量組比較，##P<0.01;與中劑量組比較，&P<0.05;與中劑量組比較，&&P<0.01

2.4各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1β水平的比較

DSS刺激A549細(xì)胞，建立DSS細(xì)胞炎癥模型。結(jié)果顯示，DSS模型組的細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1β水平高于正常細(xì)胞組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。用清肺抑火膠囊處理炎癥模型細(xì)胞24 h后，低濃度組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的IL-1β水平高于正常細(xì)胞組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;低濃度組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的IL-1β水平與DSS模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;中、高濃度組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的IL-1β水平低于DSS模型組和低濃度組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;中濃度組與高濃度組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的IL-1β水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（圖3）。

3討論

清肺抑火膠囊的主要成分具有清熱、瀉火、利咽、祛痰、免疫抑制、抗炎、抗氧化等作用[13-14]。其功能主治包括清肺止咳、降火生津，臨床上還將其用于急性支氣管炎風(fēng)熱犯肺型疾病的治療，可有效緩解患者的臨床癥狀[5]。此外，該藥聯(lián)合抗生素可減輕支氣管擴(kuò)張癥急性加重時(shí)的發(fā)作癥狀[15]。然而它對肺部疾病的典型癥狀，如咳、痰、喘的療效尚未有明確報(bào)道。

二氧化硫是一種較強(qiáng)的化學(xué)刺激性物質(zhì)，小鼠吸入后，可直接刺激呼吸道感受器，反射性引起咳嗽。本實(shí)驗(yàn)中，給予清肺抑火膠囊后，小鼠出現(xiàn)劑量依賴性的咳嗽潛伏期延長，2 min內(nèi)的咳嗽次數(shù)減少，提示該藥有鎮(zhèn)咳作用。其中高劑量清肺抑火膠囊的鎮(zhèn)咳作用與苯海拉明相當(dāng)。

小鼠祛痰實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著清肺抑火膠囊劑量的增加，小鼠呼吸道酚紅分泌量增大，提示清肺抑火膠囊可增強(qiáng)小鼠氣道分泌液體的能力。分泌的液體在呼吸道稀釋痰液，達(dá)到祛痰作用。

本研究結(jié)果顯示，清肺抑火膠囊中、高劑量組豚鼠的引喘潛伏期均長于模型組和低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），提示清肺抑火膠囊可以延長組胺的引喘潛伏期。組胺具有支氣管收縮作用，在支氣管哮喘發(fā)作中有重要意義。本研究結(jié)果還顯示，苯海拉明組的引喘潛伏期與高劑量組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。提示清肺抑火膠囊可延長組胺誘導(dǎo)的豚鼠哮喘發(fā)作潛伏期，且中、高劑量組的平喘作用與苯海拉明相當(dāng)。究其原因，清肺抑火膠囊可能通過對抗組胺、抑制支氣管收縮，發(fā)揮平喘作用。

IL-1β是一種重要的炎癥因子[16]，是哮喘氣道平滑肌高反應(yīng)性的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[17-18]，與慢性支氣管炎的咳、痰癥狀有關(guān)[19-20]。本研究用DSS處理人肺上皮細(xì)胞株A549后[21-22]，結(jié)果顯示IL-1β分泌增加，而用清肺抑火膠囊處理后，則可明顯減少該細(xì)胞受炎癥刺激后炎癥因子的釋放，抑制IL-1β水平，達(dá)到抗炎作用。這種抗炎作用可能有助于清肺抑火膠囊鎮(zhèn)咳、祛痰及平喘作用的發(fā)揮。

綜上所述，清肺抑火膠囊劑量依賴的鎮(zhèn)咳、祛痰和平喘作用與苯海拉明相似，且可能與其抗組胺和抗炎作用相關(guān)。

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（收稿日期：2019-10-12? 本文編輯：閆? 佩）