十批產(chǎn)地杜仲丸HPLC指紋圖譜的化學(xué)成分群分析

（棗莊市立醫(yī)院，山東 棗莊 277100）

杜仲為杜仲科植物杜仲的干燥樹皮[1]，全國(guó)多有栽培。續(xù)斷為川續(xù)斷科植物川續(xù)斷的干燥根[2]。杜仲、續(xù)斷在處方中常以藥對(duì)出現(xiàn)，具有補(bǔ)益肝腎，強(qiáng)筋健骨作用，而又獨(dú)立成方，等量配伍組成杜仲丸。現(xiàn)代藥理試驗(yàn)證明杜仲、續(xù)斷有調(diào)節(jié)骨密度，抗骨質(zhì)疏松等作用[1-3]。此外杜仲丸有一定的抗抑郁，抗骨質(zhì)疏松作用[4-5]。前期工作表明，鹽炙與配伍可以影響杜仲丸的藥效部位[6]。本研究采用HPLC指紋圖譜技術(shù)[7-10]，對(duì)杜仲丸化學(xué)成分群進(jìn)行分析。

1 儀器與試藥

Agilent1100安捷倫，松脂醇二葡萄糖苷、綠原酸、槲皮素、梔子苷對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)生物制品檢驗(yàn)所，續(xù)斷皂苷Ⅵ由中國(guó)藥科大學(xué)提供、蘆丁對(duì)照品為實(shí)驗(yàn)室自制，純度分別為98.5%。乙腈為色譜純。杜仲、續(xù)斷經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)周鳳琴教授鑒定[6]。杜仲：洗凈，去栓皮，切絲0.5 cm。續(xù)斷：凈制，切段。見表1。

表1 杜仲、續(xù)斷組合表

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件：色譜柱為phenomenex Cl8（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫為25 ℃，流動(dòng)相為乙腈0.1%磷酸水溶液（梯度洗脫，0～60 min，乙腈從6%線性梯度至36%），流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm，分析時(shí)間：70 min，進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 供試樣品的制備：稱取杜仲飲片剪成3 mm以下碎片，續(xù)斷粉碎，過(guò)2號(hào)篩，粉末等量混合，稱取2.00 g，置于250 mL燒瓶中，量取60%乙醇100 mL，浸泡1 h，回流3 h，雙層濾紙抽濾，于60 ℃減壓回收至無(wú)醇味，用石油醚萃取，至石油醚層無(wú)色，定容，過(guò)濾，取續(xù)濾液作為杜仲丸供試品溶液[11]。

2.3 對(duì)照品溶液的制備：稱取松脂醇二葡萄糖苷4.18 mg[12]，續(xù)斷皂苷Ⅵ5.03 mg[13-14]，綠原酸5.65 mg，蘆丁10.92 mg[15]，槲皮素3.89 mg[16]，梔子苷6.96 mg等對(duì)照品，分別置于10 mL容量瓶中，加60%乙醇溶解，過(guò)濾。并各取適量溶液，混勻，作為對(duì)照品混合溶液。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn)：取杜仲丸供試品溶液20 μL，按照“2.1”項(xiàng)所述色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次。結(jié)果11個(gè)共有峰的保留時(shí)間RSD值＜0.5%，峰面積比值RSD值＜5%。提示精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)：取杜仲丸供試品溶液20 μL，按照“2.1”項(xiàng)所述色譜條件，在0、2、4、8、16、24 h依次進(jìn)樣。結(jié)果11個(gè)共有峰的保留時(shí)間RSD值＜0.5%，峰面積比值的RSD值＜5%。提示24 h內(nèi)杜仲丸供試液穩(wěn)定性良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn)：取杜仲丸樣品6份，平行制備杜仲丸供試品溶液20 μL，按照“2.1”項(xiàng)所述色譜條件進(jìn)樣，結(jié)果11個(gè)共有峰的保留時(shí)間RSD＜0.5%，峰面積比值的RSD值＜5%。提示重復(fù)性較好。

2.5 樣品的測(cè)定：精密吸取杜仲丸供試液和對(duì)照品溶液各20 μL，按上述色譜條件進(jìn)樣分析。

2.6 指紋圖譜的建立與分析

2.6.1 共有峰的標(biāo)定：10批杜仲丸供試品溶液指紋圖譜有11個(gè)共有峰。松脂醇二葡萄糖苷、續(xù)斷皂苷Ⅵ、綠原酸、蘆丁、梔子苷、槲皮素7種標(biāo)準(zhǔn)品溶液與杜仲丸供試品溶液藥材的HPLC指紋圖譜對(duì)比分析，在相同色譜條件下只有松脂醇二葡萄糖苷、綠原酸、皂苷續(xù)斷Ⅵ的保留時(shí)間與指紋圖譜中相應(yīng)峰一致，且兩個(gè)峰的紫外吸收曲線是相同。選取6號(hào)峰為參照峰，其中杜仲丸的高效液相指紋圖譜相對(duì)保留時(shí)間穩(wěn)定，但相對(duì)峰面積差異較大，1號(hào)峰RSD為1.06，2號(hào)峰RSD為1.03，4號(hào)峰RSD為1.19，8號(hào)峰RSD為1.23、11號(hào)峰RSD為1.15。結(jié)果見圖1、2，表2、3。

圖1 杜仲丸供試品高效液相指紋圖譜

圖2 對(duì)照品高效液相色譜

表2 杜仲丸供試品特征峰和對(duì)照品的保留時(shí)間

2.6.2 相似度評(píng)價(jià)：分別將10批杜仲丸供試品溶液所得數(shù)據(jù)導(dǎo)入中藥色譜指紋相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004A版），以中位數(shù)為參數(shù)生成杜仲丸

3 討論

3.1 從指紋圖譜共有模式比較結(jié)果分析，十批杜仲丸供試品溶液都有11個(gè)特征峰，且不同產(chǎn)地相同工藝的杜仲丸的高效液相指紋圖譜相對(duì)保留時(shí)間穩(wěn)定，但峰面積差異較大，可能由于產(chǎn)地、氣候、生長(zhǎng)環(huán)境、生長(zhǎng)年份造成的差異所致。其中對(duì)化學(xué)成分1號(hào)峰、2號(hào)峰、4號(hào)峰、8號(hào)峰、11號(hào)峰的含量影響較大。

3.2 杜仲生產(chǎn)于湖北、四川、貴州、云南等省，從指紋圖譜上看在指紋圖譜的共有模式。10批杜仲丸指紋譜圖的重疊圖見圖3，共有模式見圖4，計(jì)算各批杜仲丸供試品溶液的相似度，樣品1、2、4、7、9、10相似度高于0.8，樣品5、6相似度在0.5左右。樣品1、2、4、7、9、10的杜仲來(lái)自于云南、貴州、四川。而樣品5、6的杜仲來(lái)自于陜西。提示杜仲產(chǎn)區(qū)有一定的地域性，且同一地域的杜仲差異性小。結(jié)果見表4。這幾個(gè)地區(qū)的杜仲的化學(xué)成分群含量較高，而產(chǎn)于陜西的杜仲的化學(xué)成分含量較低，表明杜仲產(chǎn)區(qū)有一定的地域性。此外本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步分析鹽炙和配伍對(duì)杜仲丸化學(xué)成分群的影響提供方法學(xué)研究。

圖3 10批杜仲丸供試品的HPLC指紋圖譜

圖4 10批杜仲丸供試品HPLC的共有模式

3.3 樣品8杜仲丸供試品的相似度為0.2，分析原因可能與杜仲藥材質(zhì)量有關(guān)，其樹皮薄，橡膠絲少，彈性弱，容易拉斷。

表3 10批杜仲丸供試品共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及峰面積

表4 杜仲丸供試品高效液相指紋圖譜相似度結(jié)果