肉蓯蓉多糖通過激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)6-HODA致帕金森病大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用

帕金森癥(Parkinson′s disease，PD)是世界范圍內(nèi)發(fā)病率僅次于阿爾茨海默病的第二大神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，臨床表現(xiàn)為靜止性震顫、肌肉強(qiáng)直、運(yùn)動(dòng)遲緩等，病理特征為腦黑質(zhì)致密部多巴胺神經(jīng)元損傷，紋狀體多巴胺水平下降[1-2]。Wnt/β-catenin信號(hào)通路在中樞神經(jīng)發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，該信號(hào)通路在PD發(fā)病過程中的作用受到越來越多關(guān)注[3]。肉蓯蓉是列當(dāng)科植物肉蓯蓉的干燥帶鱗葉肉質(zhì)莖，具有神經(jīng)保護(hù)、提高免疫力、抗衰老等多種功能[4]。有研究證實(shí)，肉蓯

蓉的有效成分肉蓯蓉多糖(cistanche deserticola polysaccharides，CDPS)通過多種細(xì)胞因子調(diào)節(jié)PD動(dòng)物模型的臨床癥狀[5]，但CDPS對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路是否具有調(diào)節(jié)作用報(bào)道較少。本研究旨在探討CDPS能否通過激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)6-羥多巴胺(6-HODA)所致PD大鼠的受損神經(jīng)起到保護(hù)作用，為PD提供新的治療思路和研究靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性成年SD大鼠45只，周齡6～7周，體重200 g左右，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。造模前實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于SPF級(jí)環(huán)境1周。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 肉蓯蓉生藥由我院中藥房提供，提取CDPS；6-HODA、抗壞血酸購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；兔抗Wnt、β-catenin單抗購(gòu)自美國(guó)Cayman公司；糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)、β-actin引物由上海生物工程有限公司合成。

1.3 PD大鼠動(dòng)物模型建立 隨機(jī)選取SD大鼠30只，以戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物固定于腦立體定位儀上，沿顱頂正中線切開皮膚，鈍性分離頭骨外膜，參考大鼠腦定位立體圖譜，確定右側(cè)紋狀體坐標(biāo)(前囟前1.0 mm，中線右3.0 mm，硬膜下4.5～5.0 mm)，將8 μg的6-HODA溶于含0.2%壞血酸的生理鹽水中，使用微量注射器抽取后，以1 μL/min速度注射于上述兩個(gè)靶點(diǎn)，注射后停針10 min，之后緩慢退針(2～3 min)。建模成功標(biāo)準(zhǔn)：建模1周后，腹腔注射阿撲嗎啡(0.5 mg/kg)，誘發(fā)大鼠旋轉(zhuǎn)，大鼠恒定向左旋轉(zhuǎn)，且30min內(nèi)旋轉(zhuǎn)圈數(shù)>210圈視為造模成功。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及干預(yù)方法 將45只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham組)、模型組(PD組)和肉蓯蓉多糖治療組(CDPS+PD組)，各15只，每組進(jìn)行不同干預(yù)。

1.4.1 CDPS+PD組 造模3周后，每日給予造模成功的SD大鼠CDPS灌胃治療，劑量為1.08 g/(kg·d)，連續(xù)治療10 d。

1.4.2 PD組 造模3周后，每日給予造模成功的SD大鼠與CDPS+PD組相同體積的生理鹽水灌胃處理，連續(xù)治療10 d。

1.4.3 Sham組 手術(shù)過程同PD組，只是注射等體積生理鹽水，3周后每日給予SD大鼠與CDPS+PD組相同體積的生理鹽水灌胃處理，連續(xù)治療10 d。

1.5 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物行為學(xué)觀察

1.5.1 游泳實(shí)驗(yàn) 第32天，將SD大鼠置于一個(gè)20cm×20cm×25cm體積水缸內(nèi)，水深10cm，水溫20～22℃，安靜環(huán)境下，記錄SD大鼠5min內(nèi)靜止時(shí)間。

1.5.2 自主活動(dòng)實(shí)驗(yàn) 第32天，制作一個(gè)30 cm×30 cm×15 cm的有機(jī)玻璃盒，底部標(biāo)注6 cm×6 cm方格，置于安靜、昏暗環(huán)境中，統(tǒng)計(jì)SD大鼠5 min內(nèi)站立次數(shù)，連續(xù)觀察5次，取平均值。

1.6 組織標(biāo)本提取 第32天，將SD大鼠以戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉(40 mg/kg)，仰位固定于工作臺(tái)上，沿腹中線剪開皮膚，暴露腹腔，預(yù)冷生理鹽水灌注心臟，取腦組織，于-80 ℃條件下保存。

1.7 蛋白免疫印跡(Western Blot)檢測(cè)SD大鼠腦黑質(zhì)內(nèi)Wnt1、β-catenin蛋白表達(dá) 將凍存的腦組織剪成碎塊，加入蛋白裂解液，離心后取上清液，電泳分離蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(NC膜)，使用含5%脫脂乳粉的TBST封閉，按順序添加一抗、二抗，洗滌NC膜，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯色，膠片掃描后使用Bandscan5.0軟件分析蛋白條帶灰度。

1.8 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)GSK-3β mRNA表達(dá) 將凍存腦組織加液氮研磨，使用Trizol提取總RNA，行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。取2 μL RNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增：內(nèi)參為β-actin，內(nèi)參引物序列，正向引物：TCGGCTATTCGGCTAGCTAGC；反向引物：TCGGTCGATTAGCTAGCCGCA；GSK-3β mRNA引物序列，正向引物：TCGATTCGATCGGGCTAGCTA；反向引物：TACGGTAGCGGCTAGCTAGG。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性2 min，1個(gè)循環(huán)；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30s，72℃延伸2min，共35個(gè)循環(huán)；72℃總延伸6 min。取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，紫外線投射儀下觀察電泳條帶，分析目的基因和參比基因的條帶灰度。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠行為學(xué)觀察結(jié)果比較 與Sham組比較，PD組游泳靜止時(shí)間增加(P<0.05)，CDPS+PD組游泳靜止時(shí)間較PD組縮短(P<0.05)；PD組自主活動(dòng)站立次數(shù)較Sham組下降(P<0.05)，CDPS+PD組站立次數(shù)明顯恢復(fù)(P<0.05)。詳見表1。

組別只數(shù)游泳靜止時(shí)間(s)自主活動(dòng)站立次數(shù)(次)Sham組1595.93±7.31①21.18±4.22①PD組 15172.19±19.02 10.24±2.35 CDPS+PD組15128.03±10.33①17.74±4.20①

與PD組比較，①P<0.05。

2.2 各組大鼠腦黑質(zhì)內(nèi)Wnt1蛋白表達(dá) PD組大鼠腦黑質(zhì)內(nèi)Wnt1蛋白表達(dá)少于Sham組(P<0.05)，且CDPS+PD組Wnt1蛋白水平較PD組提升(P<0.05)。詳見圖1。

與PD組比較，＊P<0.05。

2.3 各組大鼠腦黑質(zhì)內(nèi)β-catenin蛋白表達(dá) PD組大鼠腦黑質(zhì)內(nèi)β-catenin蛋白水平低于Sham組(P<0.05)，CDPS+PD組大鼠腦黑質(zhì)內(nèi)β-catenin蛋白水平高于PD組(P<0.05)。詳見圖2。

與PD組比較，＊P<0.05。

2.4 各組大鼠腦黑質(zhì)內(nèi)GSK-3β mRNA表達(dá) PD組大鼠腦黑質(zhì)內(nèi)GSK-3β mRNA高于Sham組(P<0.05)，CDPS+PD組腦黑質(zhì)內(nèi)GSK-3β mRNA較PD組下降(P<0.05)。詳見圖3。

與PD組比較，＊P<0.05。

3 討 論

PD是由中腦黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元選擇性退行性病變引起的[2]。近年來，Wnt信號(hào)通路在PD中的作用日益重視。Wnt根據(jù)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路不同分為兩類，在Wnt/β-catenin通路中發(fā)揮作用的是Wnt1，該通路是所有Wnt通路中重要的一條[6]。該通路在PD小鼠模型中腦黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元病理生理過程中發(fā)揮重要作用[3]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，干擾小鼠中腦β-catenin嚴(yán)重減弱多巴胺神經(jīng)元再生能力及多巴胺神經(jīng)元完整性[7]；體外研究證實(shí)，Wnt1在中腦前體細(xì)胞中促進(jìn)其分化為多巴胺神經(jīng)[8]，同時(shí)Wnt1缺失導(dǎo)致多巴胺神經(jīng)元增殖能力下降[9]。本研究結(jié)果可見，6-HODA所致PD大鼠腦黑質(zhì)組織Wnt1和β-catenin表達(dá)較Sham組大鼠均較低，說明PD大鼠腦組織內(nèi)Wnt1和β-catenin作用被阻斷，該結(jié)果與相關(guān)研究[8-9]報(bào)道一致。

GSK-3β是Wnt/β-catenin通路重要組成分子，該通路激活后，GSK-3β活性被抑制，從而增加β-catenin穩(wěn)定性[10]。Gong等[11]研究發(fā)現(xiàn)，6-HODA能激活GSK-3β，進(jìn)而導(dǎo)致中樞神經(jīng)細(xì)胞凋亡，同時(shí)GSK-3β阻斷劑可抑制PD大鼠神經(jīng)元凋亡；另有研究報(bào)道，中腦多巴胺前體細(xì)胞抑制GSK-3β活性可增加β-catenin水平，同時(shí)促進(jìn)多巴胺神經(jīng)元增殖和分化[12]。本研究結(jié)果顯示，給予SD大鼠顱內(nèi)注射6-HODA后，GSK-3β mRNA表達(dá)高于Sham組，說明6-HODA能激活GSK-3β使其表達(dá)上調(diào)，同時(shí)抑制Wnt/β-catenin通路活性。

肉蓯蓉具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗衰老等作用[4]。有研究證實(shí)，肉蓯蓉的有效成分在中樞神經(jīng)保護(hù)方面發(fā)揮重要作用，對(duì)腦卒中、PD、阿爾茨海默病等中樞神經(jīng)退行性疾病具有良好的防治作用[5]。有研究證實(shí)，肉蓯蓉中苯乙醇總苷能改善PD小鼠臨床癥狀，提高紋狀體內(nèi)多巴胺水平[13]；另有研究發(fā)現(xiàn)，松果菊苷(ECH)通過抗氧化作用而減少氧化應(yīng)激反應(yīng)，保護(hù)多巴胺神經(jīng)元免受氧化應(yīng)激損傷[14]。CDPS是肉蓯蓉的一種主要化學(xué)成分，其對(duì)PD的防治研究目前報(bào)道較少。本研究采用CDPS干預(yù)6-HODA所致的帕金森SD大鼠，治療后SD大鼠自主活動(dòng)能力提高，腦黑質(zhì)內(nèi)Wnt1和β-catenin蛋白表達(dá)較PD組提高，GSK-3β基因表達(dá)受到抑制，說明CDPS能改善PD大鼠臨床癥狀，這種作用可能通過激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路而產(chǎn)生的。

綜上所述，CDPS可改善6-HODA所致PD大鼠臨床癥狀，這種作用可能通過激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，抑制GSK-3β活性而發(fā)揮多巴胺神經(jīng)保護(hù)作用而實(shí)現(xiàn)的。今后將進(jìn)一步從細(xì)胞分子水平探討肉蓯蓉對(duì)PD動(dòng)物模型中樞神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用的具體機(jī)制。