地榆皂苷Ⅱ?qū)2O2誘導(dǎo)H9C2心肌細胞株凋亡的保護機制研究

心力衰竭是多種心血管疾病發(fā)展的終末階段，目前已成為僅次于惡性腫瘤且嚴重危害人類健康的主要疾病[1]。治療心力衰竭主要目的是防止并延緩疾病發(fā)生發(fā)展，減輕臨床癥狀，提高病人生存質(zhì)量，改善長期預(yù)后。有研究顯示，心肌細胞株凋亡是心力衰竭發(fā)生發(fā)展的重要病理基礎(chǔ)[2]，而氧化應(yīng)激反應(yīng)在心肌細胞株凋亡中發(fā)揮關(guān)鍵作用[3]。中醫(yī)中藥治療心血管疾病作用已得到臨床證實，因其安全、與西藥協(xié)同治療效果顯著被廣泛應(yīng)用[4]。中藥作用機制復(fù)雜多樣，多項研究表明，中藥可有效抑制心肌細胞株的氧化應(yīng)激反應(yīng)，地榆皂苷Ⅱ是從地榆中分離的三萜皂苷類化合物，藥理研究發(fā)現(xiàn)其具有抗氧化應(yīng)激、抑制細胞凋亡，并抗炎、消腫、止瀉和抗?jié)冏饔肹5-6]；地榆皂苷Ⅱ可有效改善化療、放療對癌癥病人造成的外周血細胞減少[7]。但地榆皂苷Ⅱ是否可抑制心肌細胞株的氧化應(yīng)激反應(yīng)研究報道較少。本研究探討地榆皂苷Ⅱ?qū)2O2誘導(dǎo)的大鼠H9C2心肌細胞株凋亡的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 地榆皂苷Ⅱ購自上海純優(yōu)技術(shù)有限公司(貨號：PO792)，分子式：C15H12O6；H9C2心肌細胞株購自中科院上海細胞庫；細胞培養(yǎng)采用達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、青鏈霉素雙抗購自Gibco公司；采用四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法(MTT)試劑及流式細胞盒購自碧云天技術(shù)(上海)有限公司；細胞裂解液購自上海聯(lián)邁生物工程有限公司；抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)鼠單克隆抗體，Bax、半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、半胱氨酸蛋白酶-9(Caspase-9)、細胞磷酸化的細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(p-ERK1/2)、卵黃狀黃斑病蛋白3(Bestrophin3)、細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(REK1/2)抑制劑LY3214996購自英國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 使用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)H9C2心肌細胞株，培養(yǎng)箱設(shè)置條件37 ℃，5%CO2，濕度為95%，每兩天換液1次，細胞密度達到培養(yǎng)皿90%時進行傳代培養(yǎng)，傳代密度為1×104個/mL。

1.2.2 實驗分組及處理 對照組(H9C2組)、H2O2組(DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后加入150 μmol/L的H2O2處理2 h)、地榆皂苷Ⅱ組、地榆皂苷Ⅱ+H2O2組(30 μg/mL地榆皂苷Ⅱ培養(yǎng)24 h，再加入150 μmol/L的H2O2處理2 h)。

1.3 MTT法測定地榆皂苷Ⅱ細胞毒性 采用二甲基亞砜(DMSO)配制100 μg/mL地榆皂苷Ⅱ溶液，置于4 ℃冰箱中保存。取對數(shù)生長期細胞，消化為單細胞懸液。以每孔100 μL鋪96孔板(5×103/孔)接種于96孔板中，每孔100 μL，放入含5%CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細胞密度達到75%，向每孔中加入不同濃度地榆皂苷Ⅱ(分別為5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、80 μg/mL、100 μg/mL)，每個濃度6個復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后每孔加入10 μL MTT溶液(5 g/L)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄上層培養(yǎng)基加入DMSO溶液100 μL，搖床37 ℃震搖10 min于450 nm波長用酶標儀測定各孔吸光度(OD值)。細胞增殖抑制率(%)=(OD對照組-OD加藥組)/(OD對照組-OD空白組)×100%。

1.4 MTT法測定地榆皂苷Ⅱ?qū)π募〖毎瓯Ｗo作用 取對數(shù)生長期的心肌細胞株每孔100 μL接種于96孔板(5×103/孔)，在37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，每組設(shè)置6個復(fù)孔，以只加DMEM培養(yǎng)液為對照組(H9C2組)，實驗組加入不同濃度地榆皂苷Ⅱ，對照組加入等體積DMEM溶液，培養(yǎng)24 h后，對照組與實驗組加入等體積150 μmol/L的H2O2溶液，對照組加入等體積的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)，培養(yǎng)2 h后，利用MTT方法，酶標儀450 nm測定，計算心肌細胞株活性。

1.5 流式細胞技術(shù)檢測細胞活性 取對數(shù)生長期心肌細胞株按 5×105/孔的密度接種于6孔板，貼壁后，按1.2所述方法分組及處理，每組3個復(fù)孔，處理孵育完畢后胰酶消化收集細胞，PBS沖洗3遍，根據(jù)凋亡檢測試劑盒protocol，重懸于5 μL的異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)集合液中，充分混勻加入5 μL 碘化丙啶(PI)輕柔充分吹打均勻后室溫避光條件下反應(yīng)20 min，對細胞進行染色、孵育。流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.6 熒光顯微鏡測定活性氧(ROS) 取對數(shù)生長期心肌細胞株按2×105/孔的密度接種于24孔板，貼壁后，按1.2所述方法分組及處理，參照ROS試劑盒protocol，注意避光操作，使用無血清培養(yǎng)基按照1︰1000比例稀釋2′，7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)，最終濃度為10 μmol/L，去除6孔板內(nèi)培養(yǎng)基，每孔各

加入1 mL DCFH-DA(10 μmol/L)，放于細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30 min。使用無血清DMEM培養(yǎng)液洗滌3次以去除未進入細胞內(nèi)的DCFH-DA；之后在熒光顯微鏡下觀察，綠色熒光強度代表ROS。

1.7 蛋白質(zhì)印跡法(WesternBlot)檢測凋亡蛋白及p-ERK1/2、Bestrophin3表達 取對數(shù)生長期心肌細胞株按2×105/孔密度接種于24孔板，貼壁后，按1.2所述方法分組及處理，采用牛血清白蛋白(BCA)法進行蛋白定量。蛋白樣品在恒溫水浴鍋中煮沸5 min，將蛋白變性。蛋白樣品經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)電泳分離后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。根據(jù)蛋白Marker位置切出目的蛋白所在條帶，置于5%脫脂奶粉配制的封閉液中封閉2 h；4 ℃條件下，目的條帶和一抗孵育過夜；使用磷酸緩沖鹽水-吐溫溶液(PBS-T)洗滌5 min，重復(fù)3次，洗去條帶上殘留一抗；室溫下將目的條帶和二抗孵育2 h；使用免疫印跡化學(xué)發(fā)光試劑盒，在核酸蛋白成像儀下顯影，分析細胞凋亡相關(guān)蛋白Bax、Caspase-3、Caspase-9表達情況，并分析各組差異。

1.8 ERK1/2與Bestrophin3之間的關(guān)系 為明確ERK1/2與Bestrophin3關(guān)系分組為：H9C2組、H2O2組、地榆皂苷Ⅱ+H2O2組及地榆皂苷Ⅱ+抑制劑組，前3組處理方法同1.5所述方法，地榆皂苷Ⅱ+抑制劑組在藥物處理前應(yīng)用抑制劑LY3214996預(yù)先處理30 min，之后加入30 μg/mL地榆皂苷Ⅱ作用24 h，再加入H2O2處理2 h后收集蛋白，利用Western Blot法檢測表達量變化。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度地榆皂苷Ⅱ?qū)9C2心肌細胞活性的影響 應(yīng)用MTT法測定不同濃度地榆皂苷Ⅱ?qū)9C2心肌細胞株活性的影響，不同濃度地榆皂苷Ⅱ培養(yǎng)24 h后H9C2心肌細胞株活性保持在85%以上，說明地榆皂苷Ⅱ在一定濃度范圍對H9C2無細胞毒性。詳見圖1。

圖1 不同濃度地榆皂苷Ⅱ?qū)9C2心肌細胞株活性的影響

2.2 地榆皂苷Ⅱ?qū)π募〖毎甑谋Ｗo作用 與H9C2組比較，H2O2組H9C2心肌細胞存活率明顯降低，說明H2O2誘導(dǎo)心肌細胞株凋亡造模成功。加入不同濃度地榆皂苷Ⅱ后發(fā)現(xiàn)細胞活性明顯提高，且隨著地榆皂苷Ⅱ作用濃度增高，細胞活性隨之升高；地榆皂苷Ⅱ濃度達到20 μg/mL及以上時，與H2O2組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，表明地榆皂苷Ⅱ可有效減弱H2O2誘導(dǎo)的細胞凋亡作用，并與作用濃度呈正相關(guān)。詳見圖2。

與H2O2組比較，＊P<0.05。

2.3 流式細胞技術(shù)檢測心肌細胞株凋亡率 H9C2組心肌細胞株凋亡率為(5.20±1.12)%，與地榆皂苷Ⅱ組(10.90±1.56)%比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；H2O2組心肌細胞株凋亡率為(46.70±3.04)%，高于H9C2組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；地榆皂苷Ⅱ+H2O2組心肌細胞株凋亡率為(34.09±2.89)%低于H2O2組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。說明地榆皂苷Ⅱ可有效抑制H2O2對心肌細胞株的損傷。詳見圖3。

圖3 流式細胞術(shù)檢測地榆皂苷Ⅱ作用于H9C2心肌細胞株凋亡率

2.4 地榆皂苷Ⅱ?qū)OS的影響 H2O2組H9C2心肌細胞株綠色熒光多于H9C2組(P<0.05)，說明H2O2通過誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生進而促進H9C2心肌細胞株凋亡；地榆皂苷Ⅱ+H2O2組熒光強度明顯少于H2O2組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。提示地榆皂苷Ⅱ可有效抑制ROS產(chǎn)生。詳見圖4。

圖4 地榆皂苷Ⅱ作用于H9C2心肌細胞株對ROS的影響

2.5 地榆皂苷Ⅱ?qū)Φ蛲鱿嚓P(guān)蛋白及p-ERK1/2、Bestrophin-3表達的影響 與H9C2組比較，H2O2組細胞凋亡相關(guān)蛋白(Bax、Caspase-3及Caspase-9)表達水平升高(P<0.05)；與H2O2組比較，地榆皂苷Ⅱ+H2O2組Bax、Caspase-3及Caspase-9表達水平下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，詳見圖5。應(yīng)用ERK1/2抑制劑后測定p-ERK1/2及Bestrophin3表達量，地榆皂苷Ⅱ+H2O2組p-ERK1/2及Bestrophin3表達量高于H2O2組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；應(yīng)用ERK1/2抑制劑后，抑制劑組p-ERK1/2及Bestrophin3表達量低于地榆皂苷Ⅱ+H2O2組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，詳見圖6。說明地榆皂苷Ⅱ可能通過促進p-ERK1/2和Bestrophin3表達發(fā)揮抑制H2O2誘導(dǎo)H9C2心肌細胞株凋亡的作用。

圖5 地榆皂苷Ⅱ?qū)Φ蛲鱿嚓P(guān)蛋白的影響

圖6 地榆皂苷Ⅱ?qū)-ERK1/2及Bestrophin3表達的影響

3 討 論

隨著人們生活水平提高及醫(yī)療科學(xué)技術(shù)發(fā)展，冠心病、高血壓等慢性疾病發(fā)病率逐年增加，心力衰竭已成為嚴重危害人類健康的重要疾病[8-9]，同時心力衰竭防治是心血管疾病的難點。心力衰竭臨床表現(xiàn)主要是呼吸困難、水腫和乏力等。相關(guān)研究數(shù)據(jù)表明有明顯臨床癥狀病人5年生存率與惡性腫瘤相當。老年人群心力衰竭發(fā)病率更高，可達10%左右；心力衰竭一旦確診，病人5年生存率男性僅為25%，女性為38%。心力衰竭高發(fā)病率與高死亡率嚴重威脅人類健康，因此對心力衰竭的防治工作尤為重要。

氧自由基(oxygen free radicals，OFR)是引起心肌細胞株凋亡的主要原因之一。OFR導(dǎo)致細胞膜通透性升高，Ca2+內(nèi)流增加，損傷蛋白質(zhì)功能[10-11]。有研究證明，Bestrophin3水平與Ca2+、Cl-通道性能有關(guān)，其過表達可有效抑制Ca2+內(nèi)流[12-13]。

中醫(yī)將“心力衰竭”歸屬于“喘癥”“驚悸”“怔忡”等范疇，多為本虛標實，實以瘀血、痰飲為主。地榆為薔薇科植物的干燥根，具有活血化瘀、通經(jīng)活絡(luò)作用，地榆皂苷Ⅱ是從地榆中分離的三萜皂苷類化合物。有文獻報道，地榆皂苷Ⅱ具有抗氧化應(yīng)激、抑制細胞凋亡作用[14-16]。急性毒性實驗中，給予小鼠最大劑量灌胃，未出現(xiàn)明顯毒性反應(yīng)[17]。相關(guān)研究證明，地榆皂苷Ⅱ可有效抑制ROS產(chǎn)生，腎臟細胞結(jié)果提示ERK1/2可促進Bestrophin3表達[18]；ROS與Bestrophin3均是影響Ca2+內(nèi)流的相關(guān)因素[19-21]，而Ca2+內(nèi)流引起心肌細胞株凋亡。

本研究使用MTT法證明地榆皂苷Ⅱ?qū)9C2心肌細胞株無毒副作用；流式細胞技術(shù)結(jié)果提示地榆皂苷Ⅱ可有效抑制H2O2對H9C2心肌細胞株損傷。熒光顯微鏡檢測ROS活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)H2O2可提高ROS活性，而加入地榆皂苷Ⅱ后ROS熒光強度明顯減弱，提示H2O2通過誘導(dǎo)H9C2心肌細胞株氧化應(yīng)激反應(yīng)從而促進其凋亡，地榆皂苷Ⅱ可有效抑制該反應(yīng)而保護H9C2心肌細胞株。Western Blot結(jié)果顯示地榆皂苷Ⅱ作用于H9C2心肌細胞株能抑制凋亡相關(guān)蛋白Bax、Caspase-3、Caspase-9表達，其與流式細胞技術(shù)及ROS活性測定結(jié)果一致。本研究結(jié)果顯示，地榆皂苷Ⅱ可促進ERK1/2及Bestrophin3表達，在加入ERK1/2抑制劑后，兩者表達均下降。上述研究結(jié)果表明地榆皂苷Ⅱ作用機制可能通過促進ERK1/2和Bestrophin3表達從而抑制ROS產(chǎn)生，抑制Ca2+內(nèi)流，發(fā)揮有效的抗心肌細胞株凋亡作用。

綜上所述，地榆皂苷Ⅱ能有效抑制H2O2誘導(dǎo)的心肌細胞株凋亡，抑制凋亡相關(guān)蛋白Bax、Caspase-3、Caspase-9表達；其作用機制可能通過激活ERK1/2信號通路，促進Bestrophin3表達，從而抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)。本研究為心力衰竭的治療提供了新的藥物選擇和治療靶點。