血清miR-223、CXCR4與冠狀動脈支架內(nèi)再狹窄的關(guān)系探討

隨著醫(yī)療技術(shù)快速發(fā)展，經(jīng)皮冠狀動脈介入治療(percutaneous coronary intervention，PCI)已成為冠心病治療的重要手段，臨床應(yīng)用率達(dá)90%以上，顯著降低冠心病血管事件的發(fā)生率和死亡率[1]。血管管腔內(nèi)介入治療創(chuàng)傷小，已成為冠心病病人首選的治療術(shù)式，同時支架植入后并發(fā)癥逐漸受到臨床關(guān)注。約10%的病人PCI術(shù)后數(shù)月內(nèi)發(fā)生支架內(nèi)再狹窄(in-stent restenosis，ISR)，是PCI術(shù)療效不佳的主要原因，嚴(yán)重影響病人的生存質(zhì)量和預(yù)后[2]。引起PCI術(shù)后ISR的發(fā)生與多個因素有關(guān)[3]。微小RNA(microRNA，miRNA)在腫瘤增殖、免疫調(diào)控、炎癥反應(yīng)和血管內(nèi)膜再生等方面發(fā)揮重要作用[4]。miRNA功能復(fù)雜，目前研究尚不深入。趨化因子是一類能使細(xì)胞發(fā)生趨化運動的小分子細(xì)胞因子。CXC族趨化因子受體4(CXC chemokine receptor 4，CXCR4)屬于CXC類趨化因子受體，是趨化因子基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(stromal cell-drived factor-1，SDF-1)受體，二者共同影響細(xì)胞遷移、組織的靶向作用[5]，但miR-223和CXCR4的表達(dá)與冠狀動脈支架內(nèi)再狹窄的關(guān)系尚不清楚。本研究擬通過檢測血清miR-233、CXCR4在有無再狹窄冠心病病人中的表達(dá)情況，旨在探討二者與PCI術(shù)后冠狀動脈支架內(nèi)再狹窄發(fā)生的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.1.1 納入標(biāo)準(zhǔn) 符合2012年美國心臟學(xué)會制定的冠心病診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]，并經(jīng)冠狀動脈造影顯示冠狀動脈狹窄75%以上，進行支架植入手術(shù)；病人和家屬知情并自愿簽署知情同意書；病人依從性好，能配合完成治療和后期隨訪。

1.1.2 排除標(biāo)準(zhǔn) 心力衰竭及重度貧血病人；惡性腫瘤病人；血液系統(tǒng)、肝膽疾病、腎功能不全和急性感染病人；合并其他心臟疾病，如風(fēng)濕性心臟病等。

1.2 臨床資料 選取2015年3月—2017年5月我院收治的冠心病病人210例為研究對象，擇期進行冠狀動脈造影檢查證實右冠狀動脈、左前降支和左回旋支中至少一支狹窄75%以上，適時進行支架植入手術(shù)治療。術(shù)后給予常規(guī)藥物治療。術(shù)后12個月內(nèi)復(fù)查冠狀動脈造影，根據(jù)造影結(jié)果分為無再狹窄組(186例)和ISR組(24例)。無再狹窄組，男92例，女94例，年齡(68.95±12.42)歲；ISR組，男13例，女11例，年齡(70.13±18.64)歲。兩組性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.3 研究方法

1.3.1 臨床資料收集 分別收集兩組性別、年齡、體質(zhì)指數(shù)(body mass index，BMI)、吸煙史，是否患有高血糖及藥物治療情況，是否患有高血壓性心臟病及藥物治療情況。松下EW-BU08J測量兩組收縮壓和舒張壓，抽取清晨空腹靜脈血，使用普朗XFA6100全自動血液細(xì)胞分析儀，檢測血液總膽固醇(total cholesterol，TC)、三酰甘油(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)和糖化血紅蛋白(HbA1c)水平。

1.3.2 冠狀動脈造影 采用德國西門子數(shù)字血管造影機(Axiom Artis FA)引導(dǎo)病人選取最佳體位，按照常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進行造影，選擇左冠狀動脈、右冠狀動脈左主干回旋支和左前降支，確定冠心病狹窄度及植入支架內(nèi)是否存在再狹窄。

1.3.3 實時熒光定量PCR檢測血清miR-223和CXCR4表達(dá)水平 兩組均在冠狀動脈造影前抽取靜脈血5 mL于抗凝管，離心后取血清備用。以德國QiaGen總RNA試劑盒提取血清總RNA，按說明書進行操作。分別采用TaKaRa生產(chǎn)的miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和qRT-PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒，按照操作說明將2 μg無雜質(zhì)完整RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。按照TaKaRa公司SYBR Green PCR master mix試劑說明加配反應(yīng)體系。qRT-PCR反應(yīng)總體系為20 μL：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)10μL，cDNA 2.0 μL，上下游引物各0.8 μL，ROX Reference Dye Ⅱ(50×)0.4 μL，ddH2O 6.0 μL，放入Bio-Rad熒光定量PCR儀進行反應(yīng)，程序設(shè)定為：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃15 s，60 ℃15 s，72 ℃15 s，共40個循環(huán)，72 ℃終延伸10 min。其中miR-223以U6為內(nèi)參基因，CXCR4以GAPDH為內(nèi)參基因，引物見表1，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。采用2-ΔΔCt計算miR-223和CXCR4相對表達(dá)量。

表1 qRT-PCR引物序列

2 結(jié) 果

2.1 兩組臨床資料比較(見表2)

表2 兩組臨床資料比較

2.2 兩組血清miR-223和CXCR4表達(dá)水平比較 ISR組血清miR-223和CXCR4表達(dá)水平均高于無再狹窄組(P<0.05)。詳見表3。

2.3 miR-223和CXCR4水平與ISR病人臨床病理特征的關(guān)系 血清miR-223和CXCR4表達(dá)與ISR病人病變部位關(guān)系不明顯(P>0.05)；血清miR-223和CXCR4表達(dá)與ISR病人病變類型和長度有關(guān)(P<0.05)。詳見表4。

組別例數(shù)miR-223/U6CXCR4/GAPDH無再狹窄組1861.02±0.181.15±0.51ISR組242.87±0.723.87±0.69 t值-29.062-23.533 P 0.000 0.000

表4 ISR病人血清miR-223和CXCR4水平與臨床病理特征的關(guān)系

2.4 血清miR-223、CXCR4表達(dá)與ISR發(fā)生因素的相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)性分析結(jié)果表明，血清miR-223、CXCR4水平與ISR病人血清TC、LDL-C水平呈正相關(guān)(P<0.05)；與ISR病人血清TG、HDL-C和HbA1c水平相關(guān)性不明顯。詳見表5。

2.5 影響冠狀動脈ISR發(fā)生的危險因素分析 Logistic分析結(jié)果顯示，血清miR-223、CXCR4、TC、LDL-C水平及高血壓、高血糖為冠狀動脈ISR發(fā)生的危險因素。詳見表6。

表6 影響冠狀動脈ISR發(fā)生的危險因素分析

3 討 論

冠心病是全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率較高的心血管疾病之一，且呈增長趨勢[7]。PCI是臨床治療冠心病的主要手段，隨著接受PCI治療的冠心病病人逐年增加，支架植入后并發(fā)癥逐漸引起研究者廣泛關(guān)注。ISR定義為冠狀動脈造影發(fā)現(xiàn)支架內(nèi)全程及支架近端、遠(yuǎn)端5 mm范圍內(nèi)管腔狹窄程度50%，是PCI術(shù)后諸多并發(fā)癥中常見的一種，嚴(yán)重影響手術(shù)治療效果和病人生存質(zhì)量[8]。ISR發(fā)生的實質(zhì)是血管對損傷的一種病理反應(yīng)。與冠狀動脈粥樣硬化慢性進展不同，PCI是相對較短時間內(nèi)發(fā)生復(fù)雜炎癥和修復(fù)過程，血管修復(fù)反應(yīng)過度導(dǎo)致再狹窄。血管彈性收縮和血栓形成在冠狀動脈支架植入后數(shù)分鐘至數(shù)小時內(nèi)完成，各種凝血因子及炎癥因子刺激平滑肌細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)形成，一般術(shù)后數(shù)月或數(shù)周內(nèi)進行，平滑肌細(xì)胞增殖導(dǎo)致新生內(nèi)膜增生是ISR發(fā)生的主要病理機制[9]。

冠狀動脈支ISR是一系列復(fù)雜的調(diào)控過程，受諸多因素影響。有研究表明，男性較女性更易發(fā)生ISR，高血糖和高血壓是影響ISR的常見原因，TC和LDL-C是冠心病的獨立影響因素并得到廣泛的重視[10]。本研究結(jié)果顯示，性別對冠狀動脈造影病人ISR的發(fā)生無明顯影響，可能是由于本研究樣本量有限造成；本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ISR組血壓、血糖、血清TC和LDL-C水平高于無再狹窄組，表明血壓、血糖和血脂影響ISR的發(fā)生，與李朝暉等[10]研究結(jié)果一致，進一步證實血糖、血壓和血脂影響冠狀動脈ISR的發(fā)生。

血管新生內(nèi)膜增生是影響ISR發(fā)生的重要因素，趨化因子在血管內(nèi)膜生成過程起關(guān)鍵作用。趨化因子是一類可驅(qū)使細(xì)胞定向遷移的細(xì)胞因子。根據(jù)氨基酸序列將其分為CXC類、CC類、CX3C類和C類4個亞類。SDF-1是CXC趨化因子家族成員，主要作用是驅(qū)使中性粒細(xì)胞、造血干細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞和心肌干細(xì)胞等遷移，參與炎癥反應(yīng)、血管新生、組織發(fā)育、腫瘤發(fā)生等生物過程[11]。CXCR4是SDF-1的特異受體，在造血功能、胚胎發(fā)育、腫瘤遷移中發(fā)揮重要作用[12]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ISR組血清CXCR4高表達(dá)病人ISR發(fā)生率高于低表達(dá)病人，推測CXCR4高表達(dá)可能通過參與新生內(nèi)膜增生，影響冠心病病人PCI術(shù)后ISR發(fā)生。Shin等[13]研究表明缺血腦組織通過miR-223途徑，調(diào)控SDF-1和CXCR4表達(dá)，推測ISR病人血清CXCR4表達(dá)上調(diào)可能與miR-223調(diào)控有關(guān)。miRNA是一類小片段非編碼區(qū)RNA，主要通過特異結(jié)合靶基因3′-UTR，調(diào)控靶基因表達(dá)[14]。miRNA參與調(diào)控細(xì)胞生長、增殖、分化、炎癥和免疫反應(yīng)等生命活動[15]。王芳等[16]研究發(fā)現(xiàn)miR-663、miR-126和miR-370在新生內(nèi)膜增生相對表達(dá)發(fā)生差異性變化。有研究表明，miR-223在胃癌治療中發(fā)揮重要作用[17]，miR-223與ISR相關(guān)研究未見報道。本研究結(jié)果表明，ISR組血清miR-223水平高于無再狹窄組，表明miR-223表達(dá)水平升高可能與冠狀動脈ISR的發(fā)生有關(guān)。Pearson相關(guān)性分析表明，ISR的發(fā)生與血清miR-223水平、血清CXCR4水平呈相關(guān)。Shin等[13]在缺血腦組織研究表明miR-223調(diào)控SDF-1表達(dá)，SDF-1激活CXCR4受體表達(dá)。本研究推測ISR發(fā)生過程可能存在類似調(diào)

控機制，即miR-223高表達(dá)調(diào)控SDF-1，激活CXCR4高表達(dá)，促進冠心病病人PCI術(shù)后內(nèi)膜增生反應(yīng)。相關(guān)性分析結(jié)果表明，血清miR-223和CXCR4水平與ISR病人血清TC、LDL-C水平呈正相關(guān)。Logistic分析表明血清miR-223、CXCR4、高血糖、高血壓、TC和LDL-C水平為冠狀動脈ISR發(fā)生的危險因素，與以往研究結(jié)果[18]一致。推測miR-223可能通過調(diào)控SDF-1表達(dá)，激活CXCR4受體表達(dá)，影響冠心病病人PCI術(shù)后ISR的發(fā)生。

綜上所述，ISR病人血清miR-223和CXCR4表達(dá)水平增高，是影響ISR發(fā)生的危險因素，推測miR-223和CXCR4高表達(dá)與ISR的發(fā)生機制有關(guān)，本研究結(jié)果可為臨床預(yù)測ISR發(fā)生提供參考。