宮頸病變患者外周血中TH1/TH2漂移狀態(tài)與T-bet/GATA-3的表達(dá)及意義

賽星月 李曉紅 杜蓉

[摘要] 目的 研究宮頸病變患者轉(zhuǎn)錄因子GATA-3、T-bet與TH細(xì)胞因子的相關(guān)性及其在外周血中的表達(dá)水平及意義。 方法 選擇2017年1月～2019年1月新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院就診的76例患者，根據(jù)宮頸液基細(xì)胞學(xué)檢測分為對照組（33例）、低度鱗狀上皮內(nèi)病變（L-SIL）組（10例）及高度鱗狀上皮內(nèi)病變（H-SIL）組（33例）。Rt-PCR檢測血清GATA-3及T-bet表達(dá)量，流式細(xì)胞學(xué)檢測三組血清TH細(xì)胞因子含量，相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析。 結(jié)果 H-SIL組、L-SIL組白細(xì)胞介素（IL）-4、IL-10表達(dá)水平高于對照組，GATA-3表達(dá)量高于對照組，L-SIL組T-bet表達(dá)量低于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.05）。IFN-γ與T-bet呈正相關(guān)（r = 0.65，P < 0.05），與GATA-3呈負(fù)相關(guān)（r = -0.51，P < 0.05）;IL-4與GATA-3呈正相關(guān)（r = 0.56，P < 0.05），與T-bet呈負(fù)相關(guān)（r = -0.72，P < 0.05）;IL-10與T-bet呈負(fù)相關(guān)（r = -0.65，P < 0.05）。 結(jié)論 L-SIL患者的外周血中表現(xiàn)為TH1細(xì)胞優(yōu)勢，T-bet的基因表達(dá)上調(diào)，而H-SIL患者表現(xiàn)為TH2細(xì)胞優(yōu)勢，T-bet的基因表達(dá)下調(diào)。可見，L-SIL、H-SIL的發(fā)生與TH細(xì)胞因子、GATA及T-bet具有相關(guān)性。

[關(guān)鍵詞] 細(xì)胞因子;轉(zhuǎn)錄因子;宮頸病變

[中圖分類號] R737.33 ? ? ? ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-7210（2020）04（b）-0076-04

Expression and significance of TH1/TH2 drift and T-bet/GABA-3 in peripheral blood of patients with cervical lesions

SAI Xingyue ? LI xiaohong ? DU Rong

Department of Gynaecology， the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University， Xinjiang Uygur Autonomous Region， Urumqi ? 830054， China

[Abstract] Objective To study the correction between transcription factors GATA-3，T-bet and TH cytokine in patients with cervical lesions and their expression level and significance in peripheral blood. Methods A total of 76 patients who were admitted to the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University from January 2017 to January 2019 were selected. According to the cervical thinprep cytologic test， they were divided into control group （33 cases）， low-grade squamous intraepithelial lesion （L-SIL） group （10 cases） and high-grade squamous intraepithelial lesion （H-SIL） group （33 cases）. The expression levels of GATA-3 and T-bet in serum were detected by Rt-PCR， and the TH cytokine levels in serum of three groups were detected by flow cytometry. Pearson correlation analysis was used for correlation analysis. Results The expressions of interleukin （IL）-4 and IL-10 in H-SIL group and L-SIL group were higher than those in control group， and the expression of GATA-3 was higher than that in control group， while the expression of T-bet in L-SIL group was lower than that in control group， and the differences were statistically significant （all P < 0.05）. IFN-γ was positively correlated with T-bet （r = 0.65， P < 0.05）， and negatively correlated with GATA-3 （r = -0.51， P < 0.05）. IL-4 was positively correlated with GATA -3 （r = 0.56， P < 0.05）， and negatively correlated with T-bet （r = -0.72， P < 0.05）. IL-10 was negatively correlated with T-bet （r = -0.65， P < 0.05）. Conclusion Peripheral blood of patients with L-SIL shows dominance of TH1 cells and up-regulated T-bet gene expression， while that of patients of H-SIL shows dominance of TH2 cells and down-regulated T-bet gene expression. It can be seen that the occurrence of L-SIL and H-SIL is related to TH cytokines， GATA and T-bet.

[Key words] Cytokines; Transcription factors; Cervical lesions

我國宮頸癌的病死率居世界第二，從正常宮頸發(fā)展為高度鱗狀上皮內(nèi)病變（H-SIL）需8～10年，此時機(jī)體的免疫狀態(tài)起到關(guān)鍵作用[1]，高危型人乳頭狀瘤病毒（HPV）持續(xù)感染是導(dǎo)致宮頸癌的主要原因[2]。研究發(fā)現(xiàn)[3-4]，低度鱗狀上皮內(nèi)病變（L-SIL）患者的T細(xì)胞主要為輔助性T細(xì)胞1（TH1型），而H-SIL患者主要為輔助性T細(xì)胞2（TH2型），宮頸組織中進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)的可能是TH1/TH2相關(guān)因子。CD4（分化群4）T細(xì)胞的表達(dá)模式分為TH1型和TH2型，而白細(xì)胞介素（IL）-2、IL-12、γ干擾素（IFN-γ）促進(jìn)TH1型分化，IL-4、IL-10促進(jìn)TH2型分化[5]，TH細(xì)胞分化受多因素調(diào)節(jié)，其中GATA-3及T-bet的調(diào)節(jié)對TH細(xì)胞分化起重要作用，T-bet正調(diào)節(jié)TH1型相關(guān)因子，GATA-3正調(diào)節(jié)TH2型相關(guān)因子，所以檢測正常人及宮頸病變患者外周血上述因子的含量及比值，可能發(fā)現(xiàn)TH1/TH2的平衡關(guān)系。為明確TH1/TH2與宮頸病變的關(guān)系，本研究檢測外周血TH1/TH2含量從而了解不同級別宮頸病變表達(dá)水平及差異。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年1月～2019年1月新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院（以下簡稱“我院”）就診的76例患者，依據(jù)WHO女性生殖系統(tǒng)腫瘤分類[6]進(jìn)行診斷，將經(jīng)宮頸液基細(xì)胞學(xué)檢測（TCT）結(jié)果分為對照組（33例），L-SIL組（10例）及H-SIL組（33例），且L-SIL組與H-SIL組經(jīng)陰道鏡活檢確診。排除受試者未受化療及免疫治療、自身免疫病、血液病、妊娠、過敏等可能影響結(jié)果的疾病。

患者均女性，對照組，年齡18～77歲，平均（42.63±14.47）歲;L-SIL組，年齡43～50歲，平均（46.4±2.42）歲;H-SIL組，年齡33～67歲，平均（46.77±10.21）歲。三組年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），具有可比性。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，受試者均簽署知情同意書。

1.2 試劑與儀器

淋巴細(xì)胞分離液（200 mL/瓶，LTS1077）購自天津TBD公司，總RNA提取試劑（Trizol）（100 mL/瓶，15596026）購自Invitrogen公司，T-bet及GATA-3引物序列由華大基因設(shè)計(jì)合成，SYBR GREEN PCR試劑盒（208054）購自凱杰有限公司，cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（#K1622）購自Thermo Scientific公司。

1.3 標(biāo)本的收集與處理

采集受試者空腹血10 mL，淋巴細(xì)胞分離液分離外周血單個核細(xì)胞，室溫下以2000 r/min離心20 min獲得單個核細(xì)胞層，移入離心管，PBS混勻，洗滌再離心得到單個核細(xì)胞，加入1 mL Trizol靜置10 min，-80℃凍存。

1.4 Rt-PCR檢測T-bet和GATA-3 mRNA表達(dá)水平

Rt-PCR檢測GATA、T-bet及內(nèi)參β-actin（各引物序列及擴(kuò)增長度見表1）。按照說明書提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄，結(jié)束進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系按說明配制，擴(kuò)增條件為：95℃ 2 min，95℃ 5 s，60℃ 10 s，共35個循環(huán)，循環(huán)后采集擴(kuò)增曲線生成熔點(diǎn)曲線。記錄循環(huán)閾值（Ct），采用2-△△Ct計(jì)算mRNA的相對表達(dá)量，其中△Ct=目標(biāo)基因Ct值-內(nèi)參β-actin Ct值。每個樣本重復(fù)3次，取平均值。

表1 ? 各引物序列及擴(kuò)增長度

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn);相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ?三組TH細(xì)胞因子水平比較

三組TH細(xì)胞因子水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.05）。H-SIL組、LSIL組中IL-4、IL-10水平高于對照組，兩組中IFN-γ、IL-2水平均低于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.05）;H-SIL組與L-SIL組TH細(xì)胞因子水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見表2。

表2 ? 三組TH細(xì)胞因子水平比較（x±s）

注：與對照組比較，*P < 0.05。L-SIL：低度鱗狀上皮內(nèi)病變;H-SIL：高度鱗狀上皮內(nèi)病變;IL：白細(xì)胞介素;IFN-γ：γ干擾素

2.2三組T-bet及GATA-3表達(dá)量比較

三組T-bet及GATA-3表達(dá)量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.05）。H-SIL組、L-SIL組GATA-3表達(dá)量明顯高于對照組，L-SIL組T-bet表達(dá)量低于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.05）。L-SIL組與H-SIL組T-bet及GATA-3表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見表3。

表3 ? 三組T-bet及GATA-3表達(dá)量比較（x±s）

注：與對照組比較，*P < 0.05。L-SIL：低度鱗狀上皮內(nèi)病變;H-SIL：高度鱗狀上皮內(nèi)病變

2.3 相關(guān)性分析結(jié)果

IFN-γ與T-bet呈正相關(guān)（r = 0.65，P < 0.05），與GATA-3呈負(fù)相關(guān)（r = -0.51，P < 0.05）;IL-4與GATA-3呈正相關(guān)（r = 0.56，P < 0.05），與T-bet呈負(fù)相關(guān)（r = -0.72，P < 0.05）;IL-10與T-bet呈負(fù)相關(guān)（r = -0.65，P < 0.05）。見圖1。

3 討論

細(xì)胞因子、胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路和核轉(zhuǎn)錄因子這三個環(huán)節(jié)是近代免疫學(xué)調(diào)控TH1/TH2的重要環(huán)節(jié)[7]，免疫調(diào)節(jié)在很多腫瘤的發(fā)展中起決定性作用[8-10]，HPV感染有自限性，可通過免疫調(diào)節(jié)控制HPV持續(xù)性感染[11]。研究顯示[12]，抗腫瘤作用依賴TH1型細(xì)胞，TH1型細(xì)胞分泌IFN-γ、IL-2等細(xì)胞因子[13];判斷宮頸癌重要指標(biāo)為IFN-γ[14]，可見細(xì)胞因子與宮頸病變密切相關(guān);TH2型細(xì)胞為IL-4、IL-10等[15]。IL-10水平上升不利于機(jī)體抗腫瘤作用，實(shí)驗(yàn)顯示[17]，IL-10水平升高可作為評估腫瘤進(jìn)展的標(biāo)志。本研究結(jié)果顯示，H-SIL組IL-10水平高于對照組，呈向TH2漂移狀態(tài);IFN-γ水平低于對照組，呈向TH1偏移狀態(tài)，提示TH1/TH2平衡狀態(tài)的改變與宮頸病變的發(fā)展有密切的聯(lián)系，這與李鋒等[12]研究相符?？梢奣H細(xì)胞因子間的平衡關(guān)系與宮頸病變發(fā)展存在一定關(guān)系。

T-bet與GATA-3是調(diào)節(jié)平衡的重要因子，本研究結(jié)果顯示，H-SIL組GATA-3表達(dá)量高于對照組，T-bet表達(dá)量低于對照組?？梢婋S宮頸病變程度加重，GATA-3含量也有上升趨勢。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)[18]，T-bet正調(diào)節(jié)TH1型細(xì)胞因子，GATA-3正調(diào)節(jié)TH2型細(xì)胞因子，TH1型特異轉(zhuǎn)錄因子為T-bet，促進(jìn)IFN-γ表達(dá)及TH1細(xì)胞因子分化;而TH2型特異轉(zhuǎn)錄因子為GATA-3，促進(jìn)TH2型細(xì)胞因子的表達(dá)[19]。本研究結(jié)果顯示，TH1型細(xì)胞因子與T-bet表達(dá)正相關(guān)，TH2型細(xì)胞因子與T-bet負(fù)相關(guān)，故推測T-bet/GATA-3與TH1/TH2的平衡有關(guān)，這在食管癌相關(guān)研究中也有體現(xiàn)[20]。

綜上所述，可通過檢測相關(guān)細(xì)胞因子含量了解患者的免疫狀態(tài)，也可將轉(zhuǎn)錄因子T-bet及GATA-3做為靶點(diǎn)，使TH1及TH2維持在平衡狀態(tài)，從而逆轉(zhuǎn)腫瘤的發(fā)生。

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（收稿日期：2019-10-17 ?本文編輯：劉明玉）