糞便基因SDC2和BMP3甲基化聯(lián)合檢測在結(jié)直腸癌篩查中的價值

潘輝 黃琰瓔 王國新 吳輝 宋慧東 黃穎烽

[摘要] 目的 探討糞便基因黏結(jié)蛋白聚糖2（SDC2）和骨形態(tài)發(fā)生蛋白3（BMP3）甲基化聯(lián)合檢測在結(jié)直腸癌篩查中的診斷性能。 方法 收集2019年5～9月廣州醫(yī)科大學(xué)附屬市十二人民醫(yī)院和中山大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院收治的64例患者糞便樣本，其中腸癌組29例、腺瘤組9例、對照組（無結(jié)直腸癌、腺瘤患者）26例。提取糞便DNA，使用甲基化特異性PCR方法，檢測三組患者糞便基因SDC2、BMP3甲基化情況，比較診斷結(jié)直腸癌、腺瘤的靈敏度和特異度。 結(jié)果 糞便基因SDC2和BMP3聯(lián)合檢測診斷結(jié)直腸癌的靈敏度高于BMP3檢測，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。SDC2、BMP3、聯(lián)合檢測診斷結(jié)直腸癌AUC值比較，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。聯(lián)合檢測AUC值高于BMP3檢測，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Z = 2.361，P < 0.05）。BMP3、聯(lián)合檢測對不同分布部位的檢出率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。結(jié)論 糞便基因SDC2和BMP3聯(lián)合檢測結(jié)直腸癌的診斷性能優(yōu)于BMP3檢測，但與SDC2檢測比較無明顯改善。

[關(guān)鍵詞] 結(jié)直腸癌;篩查;糞便基因;甲基化;黏結(jié)蛋白聚糖2;骨形態(tài)發(fā)生蛋白3

[中圖分類號] R735.3 ? ? ? ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-7210（2020）04（b）-0015-05

Value of combined detection of fecal genes SDC2 and BMP3 methylation in screening for colorectal cancer

PAN Hui1 ? HUANG Yanying2 ? WANG Guoxin3 ? WU Hui1 ? SONG Huidong4 ? HUANG Yingfeng1

1.Department of General Surgery， Guangzhou Twelfth People′s Hospital Affiliated to Guangzhou Medical University， Guangdong Province， Guangzhou ? 510620， China; 2.Department of Colorectal Surgery， Sun Yat-sen University Cancer Center， Guangdong Province， Guangzhou ? 510060， China; 3.Department of Central Laboratory， Guangzhou Twelfth People′s Hospital Affiliated to Guangzhou Medical University， Guangdong Province， Guangzhou ? 510620， China; 4.Department of Gastroenterology， Guangzhou Twelfth People′s Hospital Affiliated to Guangzhou Medical University， Guangdong Province， Guangzhou ? 510620， China

[Abstract] Objective To investigate the diagnostic performance of stool gene syndecan-2（SDC2） and bone morphogenetic protein 3（BMP3） methylation in colorectal cancer. Methods Fecal samples were collected from 64 patients admitted to Guangzhou Twelfth People′s Hospital Affiliated to Guangzhou Medical University and the Cancer Hospital Affiliated to Sun Yat-sen University from May to September 2019， of which 29 cases were in the colorectal cancer group， 9 cases were in the adenoma group， and 26 cases were in the control group （patients without colon cancer， adenoma）. Fecal DNA was extracted， and methylation-specific PCR was used to detect the methylation of fecal genes SDC2 and BMP3 of patients in three groups. The sensitivity and specificity of colorectal cancer and adenoma were compared. Results The combined detection of stool gene SDC2 and BMP3 were more sensitive than BMP3 in the diagnosis of colorectal cancer， and the differences were statistically significant （P < 0.05）. The comparison of AUC values of SDC2， BMP3， and combined detection in colorectal cancer were highly statistically significant （P < 0.01）. The AUC value of the combined test was higher than that of the BMP3 test， and the difference was statistically significant （Z = 2.361， P < 0.05）. The detection rate of BMP3 and combined detection on different distribution sites were statistically significant （P < 0.05）. Conclusion The diagnostic performance of stool gene SDC2 and BMP3 detection in colorectal cancer is better than that of BMP3 detection， but there is no significant improvement compared with SDC2 detection.

[Key words] Colorectal cancer; Screening; Fecal genes; Methylation; Syndecan-2; Bone morphogenetic protein 3

在我國，結(jié)直腸癌（CRC）是第3位常見惡性腫瘤。據(jù)國家癌癥中心報道[1]，2015年新發(fā)結(jié)直腸癌約38.8萬，因結(jié)直腸癌死亡患者約18.7萬。結(jié)直腸癌的防控關(guān)鍵是早診早治，而篩查是降低死亡率的有效方式?，F(xiàn)階段，結(jié)腸鏡檢查是結(jié)直腸癌篩查的金標(biāo)準(zhǔn)，但由于結(jié)腸鏡檢查是侵入性檢查、需繁瑣的腸道準(zhǔn)備、有穿孔的風(fēng)險等，使我國結(jié)直腸癌篩查依從性、早診早治率較低。2012～2015年我國城市開展的一項結(jié)直腸癌篩查研究報道[2]，在近18.3萬高危人群中，約2.6萬完成腸鏡檢查，參與率為14.0%，相對較低。糞便DNA檢測因其無創(chuàng)、方便、診斷效能高等優(yōu)點有望成為理想的結(jié)直腸癌篩查方式[3-5]。DNA甲基化是腫瘤（包括結(jié)直腸癌）發(fā)生發(fā)展過程中常見的早期事件，檢測特定基因的啟動子區(qū)甲基化是結(jié)直腸癌檢測的重要生物標(biāo)志物。黏結(jié)蛋白聚糖2（SDC2）是Ⅰ型細(xì)胞表面單跨膜蛋白聚糖，是硫酸乙酰肝素蛋白聚糖家族的成員。在結(jié)直腸癌中，SDC2基因啟動子區(qū)常發(fā)生異常甲基化，可做為腫瘤標(biāo)志物用于結(jié)直腸癌的篩查[6-8]。骨形態(tài)發(fā)生蛋白3（BMP3）是BMP家族成員之一，不僅在胚胎發(fā)育和器官形成中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，還能調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄，與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。已有研究顯示[9-10]，BMP3基因在結(jié)直腸癌中發(fā)揮著抑癌基因的功能。在大多數(shù)結(jié)直腸癌中，BMP3基因常發(fā)生高頻甲基化，已做為腫瘤標(biāo)志物用于結(jié)直腸癌的篩查[3]。由于結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過程是多種分子信號途徑參與的遺傳學(xué)或表觀遺傳學(xué)改變所致，聯(lián)合多個基因檢測的診斷性能優(yōu)于單個基因檢測的診斷性能[11-14]。然而，國內(nèi)外鮮見在糞便樣本中聯(lián)合檢測SDC2和BMP3基因甲基化來篩查結(jié)直腸癌的相關(guān)研究。因此，本研究以結(jié)腸鏡檢查和病理診斷作為“金標(biāo)準(zhǔn)”，利用甲基化特異性PCR（MSP）技術(shù)，檢測研究人群糞便基因SDC2、BMP3甲基化狀態(tài)，以評價其在結(jié)直腸癌篩查中的應(yīng)用價值，同時評價聯(lián)合糞便基因SDC2和BMP3甲基化檢測的診斷性能是否優(yōu)于單一基因檢測。

1 資料與方法

1.1 糞便樣本收集

本研究選取廣州醫(yī)科大學(xué)附屬市十二人民醫(yī)院和中山大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院（以下簡稱“我院”）2019年5～9月收治的64例患者的糞便標(biāo)本，包括腸癌組29例，腺瘤組9例，對照組26例。其中對照組包括非腺瘤性息肉（10例）、其他腸道病變（5例）、全大腸黏膜未見異常（10例）、神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤（1例）患者。在腸鏡檢查前或在手術(shù)前收集患者糞便，糞便在24 h內(nèi)保存至-80℃冰箱。所有患者診斷均通過結(jié)腸鏡檢查或術(shù)后病理診斷，腸癌組病理診斷均為腺癌。根據(jù)第8版AJCC結(jié)直腸癌分期系統(tǒng)[15]對腺癌進(jìn)行分期。所有患者術(shù)前均未接受化療或放療。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 主要儀器設(shè)備及試劑

T100TMPCR儀、PowerPacTM基礎(chǔ)電泳儀、Gel DocTM EZ System均購自BIO-RAD公司，QIAamp？誖Fast DNA Stool Mini Kit（163025619）、EpiTect？誖Bisulfite Kits（163017560）和EpiTect？誖 PCR Control DNA Set（1630 22382）均購自德國Qiagen公司，Premix TaqTM（Ex TaqTM Version 2.0）（AJ20771A）和TaKaRa EpiTaqTM HS（for bisulfite-treated DNA）（AIE1877A）購自寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司代為合成。

1.3 糞便DNA提取

所有糞便樣本在處理前隨機(jī)編碼，使用糞便DNA提取試劑盒從糞便樣本（180～220 mg）中提取基因組DNA，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4 亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化

為驗證提取DNA的質(zhì)量，針對人源β-actin基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。25 μL PCR反應(yīng)體系包括：Premix Taq（Ex Taq Version 2.0）12.5 μL，引物β-actin-F（5′-TGGTGATGGAGGAGGCTCAGCAAGT-3′）和β-actin-R（5′-AGCCAATGGGACCTGCTCCTCCCTTGA-3′）各0.4 μmol/L，1 μL糞便DNA。PCR反應(yīng)條件為：95℃，5 min，95℃，30 s;63℃，30 s;72℃，30 s;40次循環(huán);72℃，10 min。若成功擴(kuò)增出目的條帶（133 bp），使用亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化試劑盒將基因組DNA進(jìn)行修飾，將未發(fā)生甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不變。

1.5 MSP技術(shù)

轉(zhuǎn)化后的DNA作為模板DNA用于后續(xù)MSP技術(shù)檢測。25 μL PCR反應(yīng)體系包括：TaKaRa EpiTaq HS（5 U/μL）0.125 μL，10×EpiTaq PCR Buffer（Mg2+ free）2.5 μL，25 mmol/L MgCl2 2.5 μL，dNTP Mixture 3 μL，正向引物1 μL，反向引物1 μL，模板DNA 2 μL。反應(yīng)條件為：95℃，5 min;95℃，30 s;54～62℃，30 s;72℃，30 s;40個循環(huán);72℃，10 min。EpiTect PCR Control DNA作為陽性對照，水作為陰性對照。擴(kuò)增產(chǎn)物在3%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳分離，然后進(jìn)行凝膠成像。甲基化檢測結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：僅出現(xiàn)甲基化條帶而不出現(xiàn)非甲基化條帶或甲基化和非甲基化條帶均出現(xiàn)視為甲基化;僅出現(xiàn)非甲基化條帶而不出現(xiàn)甲基化條帶視為非甲基化。判定聯(lián)合檢測結(jié)果陽性的標(biāo)準(zhǔn)是只要有一個基因甲基化陽性即判定該樣本為陽性。引物序列見表1。

表1 ? SDC2和BMP3引物序列

注：M：甲基化;U：非甲基化;F：正義鏈;R：反義鏈。SDC2：黏結(jié)蛋白聚糖2;BMP3：骨形態(tài)發(fā)生蛋白3

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 16.0和MedCalc 15.2統(tǒng)計軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析。計數(shù)資料以例數(shù)或百分比表示，采用χ2檢驗或Fisher′s確切概率法。使用ROC曲線評價診斷試驗的準(zhǔn)確性，并計算曲線下面積（AUC）。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基本信息

腸癌組29例，其中男17例，女12例，平均年齡（57.7±13.7）歲;腺瘤組9例，男7例，女2例，平均年齡（61.1±12.2）歲;對照組26例，男11例，女15例，平均年齡（56.0±15.6）歲。三組患者性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），具有可比性。

2.2 糞便基因SDC2和BMP3聯(lián)合檢測與單基因檢測比較

聯(lián)合檢測結(jié)直腸癌靈敏度高于BMP3單基因檢測，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（χ2 = 9.032，P < 0.01）;與SDC2單基因檢測比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。聯(lián)合檢測腺瘤靈敏度與SDC2、BMP3單基因檢測靈敏度比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。聯(lián)合檢測結(jié)直腸癌和腺瘤靈敏度與SDC2、BMP3單基因檢測比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。見圖1、表2。

2.3 糞便基因SDC2、BMP3、聯(lián)合檢測診斷結(jié)直腸癌ROC曲線

SDC2基因（AUC = 0.751，95%CI：0.616～0.857）、BMP3基因（AUC = 0.686，95%CI：0.546～0.804）、聯(lián)合檢測診斷（AUC = 0.818，95%CI：0.690～0.909）結(jié)直腸癌的AUC值比較，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。聯(lián)合檢測AUC值高于BMP3檢測，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Z = 2.361，P < 0.05）。聯(lián)合檢測AUC值與SDC2檢測比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。見圖2。

2.4 腸癌組患者不同臨床特征SDC2、BMP3甲基化陽性率比較

SDC2、BMP3、聯(lián)合檢測檢出率在不同年齡、性別、腫瘤大小、TNM分期、分化程度比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P > 0.05）。SDC2對不同分布部位檢出率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），而BMP3、聯(lián)合檢測檢出率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。見表3。

3 討論

理想的結(jié)直腸癌篩查方式應(yīng)該具備簡單、方便、人群依從性高等特點，更重要的是診斷性能高。無論是SDC2，還是BMP3，單一基因檢測均能區(qū)分結(jié)直腸癌、腺瘤和對照患者;然而，單一基因檢測結(jié)直腸癌的靈敏度偏低，容易遺漏較多腸癌患者?，F(xiàn)階段，局部浸潤、區(qū)域侵犯、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者5年生存率分別為90.0%、71.0%、14.0%[16]。因此，在篩查中需要提高發(fā)現(xiàn)Ⅰ～Ⅲ期直腸癌患者靈敏度，對這些患者的獲益更大。聯(lián)合檢測診斷結(jié)直腸癌的靈敏度高于BMP3檢測，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05），同時保持較高的特異度;但是，當(dāng)聯(lián)合檢測與SDC2檢測靈敏度比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。本研究結(jié)果顯示，聯(lián)合檢測優(yōu)于BMP3檢測，尚不能認(rèn)為聯(lián)合檢測優(yōu)于SDC2檢測。若需證實糞便基因SDC2和BMP3聯(lián)合檢測優(yōu)于SDC2基因檢測，擴(kuò)大樣本量可能是一個可行的方式。

另外，本研究結(jié)果顯示，所有近端結(jié)腸癌患者均未檢測到BMP3基因甲基化，遠(yuǎn)端結(jié)直腸癌患者BMP3基因甲基化陽性率為56.5%。本研究中，BMP3基因甲基化檢測容易遺漏近端結(jié)腸癌患者。然而，Loh等[10]發(fā)現(xiàn)，近端結(jié)直腸癌組織BMP3基因甲基化陽性率為79.3%，與遠(yuǎn)端結(jié)直腸癌組織陽性率（30.0%）比較，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。除引物序列不同和基因組DNA來源不同外，本研究近端結(jié)直腸癌患者納入例數(shù)較少，也是造成差異的重要原因。

以往研究顯示[17]，糞便基因BMP3甲基化檢測結(jié)直腸癌、進(jìn)展期腺瘤靈敏度分別為40.0%、33.3%，特異度為85.0%，與本研究結(jié)果相似。若聯(lián)合SFRP2、TFPI2、NDRG4、BMP3檢測，則能提高檢測結(jié)直腸癌、進(jìn)展期腺瘤靈敏度。然而，特異度降至55.0%[17]。柏愚等[13]研究顯示，聯(lián)合糞便基因SDC2和SFRP2檢測能夠顯著提高檢測腸癌靈敏度?？梢姡喟悬c檢測是提高診斷結(jié)直腸癌靈敏度的有效方式，然而卻降低了特異度。另外，Chen等[18]研究顯示，聯(lián)合糞便基因SEPT9、NDRG4、SDC2甲基化檢測能改善單一基因檢測的診斷效能低的不足，但聯(lián)合糞便基因BMP3、SEPT9、NDRG4、SDC2甲基化檢測并不能顯著改善診斷準(zhǔn)確度。Sun等[19]研究顯示，聯(lián)合糞便基因SDC2和SFRP2、KRAS突變和糞便潛血，檢測CRC、腺瘤的靈敏度分別為91.4%、60.0%，特異度為86.1%。以上研究顯示，多靶點糞便基因檢測結(jié)直腸癌的診斷效能優(yōu)于單一基因檢測的診斷性能。多靶點糞便基因檢測已于2016年被納入美國預(yù)防服務(wù)工作組推薦的結(jié)直腸癌篩查方式[20]，但到目前為止，多靶點基因檢測在國內(nèi)尚處于探索階段。增加1個或多個靶點檢測增加了檢測成本，從眾多腫瘤標(biāo)志物里篩選出符合國人特性的數(shù)個腫瘤標(biāo)志物不是一件容易的事。因此，建立基于結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展分子模型的多靶點檢測應(yīng)該是現(xiàn)階段的研究方向。

本研究存在以下幾點不足：首先，小樣本量造成的分類偏差大，特別是腺瘤組;其次，疾病譜偏倚，所選的對照組不足以代表非結(jié)直腸癌、非腺瘤患者，還需納入存在上消化道病變、炎癥性腸病、肝癌等患者;最后，本研究并未獨立進(jìn)行糞便潛血檢測，無法與糞便潛血檢測的診斷性能做比較。

綜上所述，聯(lián)合糞便基因SDC2和BMP3甲基化檢測結(jié)直腸癌的診斷性能優(yōu)于BMP3檢測，但與SDC2檢測比較無明顯改善。

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（收稿日期：2019-12-08 ?本文編輯：王曉曄）