阿爾茨海默癥動物模型研究概述及其非實驗死亡原因的分析

張慧葉 種文強 李昂 王夢靜 趙嫻 邢文文 劉奇

[摘要] 本文簡要介紹阿爾茨海默癥（AD）動物模型并對動物實驗中非實驗死亡因素進行分析。通過查閱、整理并總結大量文獻，對AD常用動物模型進行概述，并探討環(huán)境、運動因素與AD動物模型非實驗死亡原因的相關性。環(huán)境因素中動物飼養(yǎng)密度與規(guī)律運動是影響AD模型動物的存活率及實驗結果。建立理想的AD動物模型，以期為實驗研究中AD動物模型的科學選擇提供參考。此外，采取動物種群密度飼養(yǎng)的調控、規(guī)律運動的方式，高模型動物的安全性評價，更好地保障實驗結果的客觀性。

[關鍵詞] 阿爾茨海默癥;動物模型;非實驗死亡;環(huán)境因素

[中圖分類號] R332 ? ? ? ? ?[文獻標識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-7210（2020）04（c）-0036-06

Overview of animal model study of Alzheimer′s disease and analysis of non-experimental causes of death

ZHANG Huiye1 ? CHONG Wenqiang1 ? LI Ang1 ? WANG Mengjing1 ? ZHAO Xian1 ? XING Wenwen2 ? LIU Qi1

1.Academy of Acupuncture， Shaanxi University of Chinese Medicine， Shaanxi Province， Xi′an ? 712046， China; 2.College of Basic Medical， Shaanxi University of Chinese Medicine， Shaanxi Province， Xi′an ? 712046， China

[Abstract] This paper briefly introduces the animal model of Alzheimer′s disease （AD） and analyzes the non-experimental death factors in animal experiments. By consulting， sorting out and summarizing a large number of literatures， this paper gives a overview of the common animal models for AD， while investigates the correlation between environmental factors， motor factors and non-experimental causes of death in AD animal models. The animal feeding density and regular exercise in environmental factors affect the survival rate and experimental results of AD model animals. Establish an ideal AD animal model， in order to provide a reference for the scientific selection of AD animal models in experimental research. In addition， the control of animal population density feeding and regular exercise are adopted to evaluate the safety of high-model animals to better ensure the objectivity of the experimental results.

[Key words] Alzheimer′s disease; Animal models; Non-experimental death; Environmental factors

阿爾茨海默癥（Alzheimer′s disease，AD）是一種以進行性記憶減退、智力衰減、認知障礙為主要臨床表現(xiàn)的神經(jīng)退行性疾病[1]。隨著老齡化的趨勢，AD發(fā)病率、死亡率持續(xù)增加，且有明顯的病理學特征[2]。深入研究AD的發(fā)病機制，是探索新治療方法和新藥物的必要前提，實驗中選擇合適的AD動物模型就變得尤為重要。此外，本團隊長期從事針灸防治AD相關機制研究，發(fā)現(xiàn)AD模型動物在飼養(yǎng)和干預過程中常會出現(xiàn)不明原因死亡。為保證研究工作順利進行，并提高實驗動物使用率，本文對常見的AD模型動物進行綜述，對可能導致動物非實驗死亡因素進行分析。主要針對環(huán)境因素與非實驗因素死亡的相關性進行探討，闡釋規(guī)律運動如何降低非實驗因素死亡的風險。以期為研究者選擇合適的動物模型提供參考，并對動物使用提供借鑒。

1 AD動物模型

1.1 衰老型AD動物模型

AD多發(fā)于老年人，衰老型AD動物模型是根據(jù)年齡老化為AD的重要危險因素之一而建立，主要為自然衰老、快速性衰老模型[3-5]。此類模型動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)可出現(xiàn)海馬錐體細胞數(shù)量減少、皮層神經(jīng)元相關蛋白表達降低、線粒體能量代謝障礙等特征性改變，表現(xiàn)出學習記憶障礙、認知障礙、行動遲緩等明顯衰老跡象[4]，但自然衰老動物模型腦內極少形成神經(jīng)纖維纏結及老年斑。而嚙齒類及一些非靈長類動物的自然衰老動物存在自發(fā)的病理性淀粉樣沉淀，甚至表現(xiàn)tau病變，同時伴隨著認知功能障礙、膽堿能功能低下[6-8]。

1.1.1 自然衰老模型 ?狗是一種非常適合作為研究衰老和神經(jīng)退行性疾?。ㄓ绕涫茿D）的衰老模型。狗神經(jīng)系統(tǒng)、組織病理學及行為學等方面與AD患者高度符合，尤其是狗Aβ1-42氨基酸序列與人一致，適合研究行為干預、抗氧化飲食、免疫療法的療效[3，6]。而自然衰老的鼠沒有特征性AD病理樣改變，故針對病理特征的藥物開發(fā)有待進一步研究。但對于衰老相關的認知障礙、學習記憶能力減退等方面可用于藥物研究[9]。此模型的認知障礙改變與年齡增長呈正相關，且由于自然發(fā)生，更接近人類AD的病理改變。但其腦內難以形成AD神經(jīng)元纖維纏結及淀粉樣沉積的典型病理特征，因此，自然衰老模型不能完全模擬AD的病理變化，且老齡動物難以大批量成功飼養(yǎng)、模型造模時間長、易在造模過程中發(fā)生死亡。

1.1.2 快速老化型（SAM）模型 ?SAM是近交繁育培養(yǎng)AKR/J的老化鼠，包括快速老化的P系（SAMP）和正常衰老的R系（SAMR）。SAM廣泛用于與衰老、癡呆相關的疾病研究，SAMP模擬快速衰老，而SAMR保留正常老化?？焖倮匣∈螅⊿AMP）有12個亞系，且各亞系之間的病理表現(xiàn)具有差異性。SAMP1以免疫功能降低為主要表現(xiàn)，SAMP2以肺部病理改變?yōu)橹?，SAMP3主要作用于骨關節(jié)疾病，SAMP6表現(xiàn)在主動脈異常[10]，SAMP8主要用于衰老及學習記憶能力的研究，SAMP9為白內障，SAMP10適用于腦萎縮及與衰老相關的情志異常方面研究[11]。SAMP8模型小鼠表現(xiàn)出明顯的認知障礙、神經(jīng)遞質改變和氧化代謝異常，且Aβ異常沉積發(fā)生率顯著高于正常小鼠[12];星形膠質細胞較早出現(xiàn)氧化應激損傷、能量代謝障礙、學習記憶功能減退[13-14]。SAMP8小鼠腦內的病理學改變能夠較好地模擬AD及老化腦的病理特征[15]，目前是研究與衰老相關學習記憶障礙發(fā)生機制較好的動物參考模型，并廣泛用于探討學習記憶功能障礙的基本機制。研究衰老相關性疾病，評價衰老、癡呆及學習記憶功能改善的藥物，是個極佳的理想模型，具有價格相對昂貴、實驗動物壽命較短、Aβ沉積發(fā)生更早和發(fā)生率更高等特點[16]。

1.1.3 D-半乳糖（D-gal）誘導的AD動物模型 ?D-gal是哺乳動物體內存在的一種單糖，參與人體的氧化代謝。當D-gal處于正常水平時，D-gal與磷酸尿苷酰轉移酶和半乳糖激酶相互作用轉化為葡萄糖，參與葡萄糖代謝。然而，當D-gal濃度過高時，在半乳糖氧化酶作用下產(chǎn)生大量活性氧（ROS），導致氧化應激[17]，進一步誘導并加速多器官、多系統(tǒng)的老化過程?；谘趸瘧ず退ダ隙际菍е翧D發(fā)病的重要因素，故建立了皮下或腹腔注射D-gal誘導的AD動物模型。該模型主要用于衰老狀態(tài)下AD的機制研究，但缺乏臨床上AD發(fā)病的病理性特征，如Aβ沉積、神經(jīng)纖維纏結的形成、神經(jīng)元損傷等。

1.2 轉基因嚙齒類動物模型

研究顯示[18-26]，轉基因AD動物模型已被證實：小鼠、大鼠和非哺乳動物使用較頻繁，如斑馬魚、線蟲、果蠅等。目前轉基因APP模型（PDAPP）、2576型（Tg2576）和APP23鼠模型廣泛用于實驗研究[27]，且均基于Aβ級聯(lián)假說，主要表現(xiàn)為Aβ沉積、tau蛋白異常磷酸化、腦淀粉樣血管病、腦萎縮、神經(jīng)元凋亡、認知缺陷和行為障礙[24]。研究者又采取基因修飾建立AD突變PSEN（PSEN）相關的轉基因鼠模型，用于AD發(fā)病機理及防治相關的研究。研究顯示[28]，APP/PSEN雙轉基因模型比 APP單轉基因模型鼠更明顯形成Aβ病理改變，從而證實了基因PSEN的突變功能。APP/PSEN轉基因鼠大腦表現(xiàn)為認知功能障礙、行為遲緩、突觸丟失、神經(jīng)炎性等特征[24]，但缺乏神經(jīng)纖維纏結（NFT）的形成。隨著轉基因技術的發(fā)展，人類突變tau蛋白轉基因模型解決了此困惑，tau基因敲除鼠模型可用于AD中tau相關的退行性神經(jīng)病變[29]。隨后建立的tau蛋白和APP雙轉基因模型，支持了淀粉樣蛋白級聯(lián)假說，且Aβ病理改變可誘導tau蛋白病變，表現(xiàn)為淀粉樣蛋白的大量沉積、tau蛋白的異常磷酸化、神經(jīng)元的凋亡及類似AD的纏結前狀態(tài)[25]。值得深究的是，老年斑塊和NFT在AD相關的腦區(qū)沒有明顯共存研究，且轉基因鼠模型的建立耗時耗財，某種程度上制約了長時程的癡呆模型的發(fā)展與應用。由于AD的發(fā)病與環(huán)境也密切相關，轉基因模型存在一定的缺陷，值得進一步考究。

1.3 外源性誘導模型

外源性有害物質注入可制備病理特征性明顯的AD模型，包括Aβ注入誘導、秋水仙堿誘導、鋁中毒誘導、鏈脲佐菌素（STZ）誘導、莨菪堿誘導模型及東岡田酸（OA）、興奮性毒素誘導的損傷模型等。各個誘導型模型表現(xiàn)的病理性特征有差異性，Aβ注入和STZ誘導型共同表現(xiàn)有Aβ沉積、tau蛋白異常磷酸化、膽堿能的缺失，但前者不符合AD慢性起病特點，且造模的注射位點對腦組織造成不同程度的損傷，而后者造模死亡率高，無NFT和老年斑的形成;對于鋁中毒型可表現(xiàn)為神經(jīng)元變性及凋亡、學習記憶障礙，但造模周期較長、中樞膽堿能活性未降低、NFT不明顯;東莨菪堿誘導模型被證實主要表現(xiàn)為膽堿能病變、記憶認知損傷，但無明顯AD典型病理特征，如神經(jīng)元變性、Aβ的沉積等[30]。

目前常用的AD動物模型的制備思路主要以模擬AD病理、生理、臨床特征為目標。為達到理想模型的建立，首先必須有明顯病理學特征：SP和NFT;其次具備特征性的病理變化：神經(jīng)元凋亡、突觸丟失和星形膠質細胞增多等征象;最后表現(xiàn)明顯的記憶、認知功能障礙[31]。由于目前無法建立完美的AD動物模型，在進行AD疾病機制及防治藥物的實驗研究篩選時，采用非單一AD動物模型更有說服力。今后模型的建立應采取多模型結合，不斷完善AD動物模型，為進一步探索AD的發(fā)病機制及防療藥物的實驗研究。

2 AD動物模型非實驗因素死亡原因的剖析

目前，AD動物實驗多采用SAM鼠和APP轉基因鼠，后者造模周期長且基因多不穩(wěn)定。SAM小鼠是一種比較理想的AD衰老模型，但死亡率較高。該部分主要通過探討環(huán)境因素對AD動物模型死亡的影響，剖析嚙齒類動物引起死亡的組織病變。目前國內外研究有待統(tǒng)一非實驗因素安全性評價動物死亡原因的分析方法，故不能準確判斷及分析動物實驗的非實驗死亡原因，極大地影響了動物實驗研究的結果以及組織病理學評價。

2.1 環(huán)境因素對AD實驗動物的重要性

實驗動物的環(huán)境條件包括自然因素和人為因素。自然因素是指動物實驗除設施外的環(huán)境，其環(huán)境質量優(yōu)劣可直接影響實驗動物的質量，主要指氣候因素、飼養(yǎng)室內的空氣清潔度，氣候又包括溫度、濕度、氣流與風速等。人為因素是指對實驗動物的飼育，其對實驗動物的質量和反應亦有直接影響。因實驗動物全程被限制在一個有限的動物實驗區(qū)內生存，當這些環(huán)境條件，尤其是人為因素（飼養(yǎng)條件）的變動，會對實驗動物和動物試驗的結果造成直接的干擾。

2.1.1 動物實驗室的建設要求 ?動物房的飼養(yǎng)環(huán)境須是SPF級，室內溫度：20～26°C;日溫差：≤4°C;相對濕度：40%～70%;換氣次數(shù)：15～20次/h;氣流速度：≤0.2 m/s;壓強梯度：20～50 Pa;空氣潔凈度：7級;菌落數(shù)：≤3個/皿;氨濃度：≤14 mg/m3;噪聲：≤60 dB;最低工作照度：≥200 lx;動物照度：15～20 lx;晝夜明暗交替時間：12/12 h。因造模后的動物生命體質相對脆弱，實驗室建設條件必須是嚴格按照國家動物實驗之要求，若溫度、濕度或氣候因素出現(xiàn)波動，不僅影響實驗質量，且會導致動物生命的不穩(wěn)定性，甚至能造成實驗動物的死亡。

2.1.2 人為因素與非實驗因素死亡的相關性 ?人為因素是指能主觀調整并控制的因素，可避免動物非實驗因素死亡及影響動物實驗結果的一類環(huán)境因素，主要指實驗動物的居住環(huán)境，包括飼養(yǎng)動物的籠具、飼養(yǎng)方式、動物的飼養(yǎng)密度、墊料、飲水等。籠具的質地和構造的不同對動物的質量及實驗結果都會產(chǎn)生嚴重影響，選用籠具的標準必須是無毒、易消毒滅菌、易沖洗、耐高壓、耐用材料制成，并應符合動物生理生態(tài)及防逃逸的要求，其中動物飼養(yǎng)密度嚴重影響動物的存活率[32]。

動物種群的飼養(yǎng)密度不同，其動物的攻擊行為及水平有明顯差異。當密度升高時，棲息地內單個動物的領域、食物等資源都會出現(xiàn)相對減少，而種群內斗爭勢必劇烈，通過直接攻擊或打斗行為來提高自身的生存機會。研究顯示[27]，全雌/單雄種群中雌性呈現(xiàn)類似雄性化的侵襲行為，主要表現(xiàn)為對同類攻擊和自我防衛(wèi)行為顯著增加[33]。自然種群的密度與個體間的攻擊行為呈相關性[34-35]，研究監(jiān)測動物的攻擊行為顯示，種群高峰期個體的侵襲性行為最高。在高峰期，同一環(huán)境中的種群密度越大，又因有限的生存空間、食物的競爭和捕食的壓力，使種群之間的攻擊行為明顯增大，最終導致動物種群密度降低。Dong等[36]發(fā)現(xiàn)集群飼養(yǎng)大倉鼠時，打斗較為激烈，且死亡率明顯增加。一些學者[34-35]對根田鼠的侵襲行為進行研究，發(fā)現(xiàn)攻擊及爭斗行為與種群密度呈顯著正相關。故種群的飼養(yǎng)密度、雜合度、基因型等不同，其攻擊行為強度呈明顯變化，甚者會影響種群存活率[33，37]。

2.2 嚙齒類AD模型動物可能引起死亡的組織學病變

國內外病理學家通過觀察模型動物的表現(xiàn)及剖檢病變、實驗室檢查及病理學檢查結果等，對可能引起動物死亡的年齡相關病變以及給藥誘導的病變進行綜合分析，如嚴重的腎臟或肺臟病變、惡性腫瘤、膿毒或敗血癥，這些組織病變嚴重影響了嚙齒實驗動物的生理穩(wěn)態(tài)平衡[38-40]。且不同品系大小鼠的死亡原因也有顯著差異，即使同一品系大小鼠，其死亡原因差異明顯。如Wistar大鼠雄性與雌性的死亡原因（循環(huán)系統(tǒng)、肺臟疾病、生殖系統(tǒng)、腎病等）也存在差異，但要排除老齡大小鼠的牙齒和骨骼病變、神經(jīng)和肌肉衰退病變導致活動能力顯著下降的非病理性死亡因素[41-44]。

3 規(guī)律運動對AD動物模型非實驗因素死亡的影響

最新的ACSM/AHA對老年人的建議[45]：中等強度的有氧運動可以改善和維持老年人健康，規(guī)律鍛煉對身體結構和認知健康是非常重要的，可延緩甚至阻止許多慢性疾病的誘發(fā)。據(jù)報道[46]，中等強度的體育活動對認知功能具有有益作用，故中年期開始規(guī)律運動可以延緩老年期的認知障礙。流行病學研究[47]也證實規(guī)律運動可防治氧化應激參與的相關疾病，但運動作用于大腦的機制研究尚未闡清。研究顯示[48]，適當?shù)捏w育運動對不同腦區(qū)抗氧化酶活性的影響不同。如腦干和舊紋狀體，運動可明顯增強超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶等抗氧化酶活性，而運動對參與學習記憶的大腦皮層和海馬的抗氧化酶活性的作用也存在差異。

武田等[49]證實運動能夠防止Aβ1-40誘導的抗體神經(jīng)毒性。8周的游泳訓練可明顯改善抗體Aβ1-40肽注射腦室內誘導的認知障礙，且游泳運動對小鼠海馬體和前額葉皮層的氧化應激起抑制作用[50]。大量文獻研究顯示[51-52]，游泳運動后的小鼠可明顯改善AD的學習記憶、認知功能，證實運動對AD可起到保護作用和預防作用。實驗動物的游泳運動相當于模擬小鼠的行為學水迷宮檢測方法，故水迷宮運動可防止Aβ1-40誘導的記憶能力下降，氧化應激和炎性反應，且支持運動可以降低非實驗因素死亡的風險。

4 小結

綜上所述，研究制備與人AD臨床相似的理想動物模型尤其重要，是模型應用的前提條件。AD發(fā)病機制較為復雜，建立一種能夠全面模擬、體現(xiàn)患者病理、行為等全部特征的理想動物模型需要進一步探索。然而，建立更加理想的AD模型是探究AD發(fā)病機制和防治措施的強有力的實驗工具。隨著對AD發(fā)病機制研究的不斷深入，AD動物模型也將更加完善。而更加完美的AD動物模型對于臨床針灸治療AD的研究具有積極意義，進一步推動和促進AD的防治。本文探討AD動物非實驗因素死亡的原因主要與環(huán)境因素里的人為因素相關，這種主觀調控的種群密度決定著動物的存活率，且呈線性相關，故要克服動物實驗條件的有限性來降低非實驗因素死亡的風險。此外，可通過規(guī)律運動防止AD非實驗死亡的發(fā)生，以期為研究提高動物質量和實驗結果。同時，通過研究嚙齒類AD模型動物引起死亡的組織學病變，為嚙齒類動物非實驗因素死亡原因提供安全性評價。

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（收稿日期：2019-11-15 ?本文編輯：王曉曄）