?辣椒疫霉病拮抗菌LRS-1固體發(fā)酵條件優(yōu)化及其抑菌穩(wěn)定性研究

張亮 張周 譚麗 盛浩 袁紅 鄧立平

摘 要：為了生防型多粘類芽孢桿菌LRS-1的大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用，以LRS-1固體發(fā)酵活菌數(shù)為指標，研究了麥麩和草炭基本基質(zhì)配比、碳源、氮源、初始含水量以及發(fā)酵時間、接種量、種齡等條件對LRS-1菌株固體發(fā)酵效果的影響;同時，以平板抑菌率為指標，研究了溫度和pH值對LRS-1抑菌穩(wěn)定性的影響。結(jié)果表明：LRS-1的最優(yōu)固體發(fā)酵條件為麥麩與草炭的比例為30∶20，大米添加量12%，小米添加量25%，初始含水量80%，發(fā)酵時間6 d， 接種量30%，種齡72 h;LRS-1在30℃左右與中堿性環(huán)境中可以保持穩(wěn)定的抑菌效果。

關(guān)鍵詞：生防型多粘類芽孢桿菌LRS-1;固體發(fā)酵;抑菌穩(wěn)定性

中圖分類號：Q939.92文獻標識碼：A文章編號：1006-060X（2020）04-0001-05

Optimization of Solid Fermentation Conditions for LRS-1 against Phytophthora capsicum Disease and Its Antibacterial Stability

ZHANG Liang1，ZHANG Zhou1，TAN Li2，SHENG Hao1，YUAN Hong1，DENG Li-ping3

（1. College of Resources and Environment， Hunan Agricultural University， Changsha 410128， PRC;

2. Soil Fertilizer Station， Liling Agricultural Bureau， Liling 412200， PRC;

3. Agricultural Technology Promotion Center， Liling 412200， PRC）

Abstract： In order to explore the optimal solid fermentation conditions of Paenibacillus polymyxa LRS-1 and its bacterial inhibition stability， and provide the necessary technical support for the LRS-1's mass production， the effects of the ratio of wheat bran and peat， carbon source， nitrogen source， initial water content ， fermentation time， inoculum size and inoculum age on the solid fermentation effect of LRS-1 with the number of viable bacteria as index， as well as the effect of temperature and pH value on its antibacterial stability with antibacterial rate as index was studied in this paper. The final results showed that the optimal solid fermentation conditions of LRS-1 were：the ratio of wheat bran and peat 30∶20， 12% rice and 25% millet， initial water content 80%， fermentation time 6 d，? inoculum size 30%， inoculum age 72 h. Antibacterial stability showed that at around 30℃ in medium alkaline environment， LRS-1 could maintain the stable antibacterial effect .

Key words： Paenibacillus polymyxa LRS-1; solid fermentation; antibacterial stability

辣椒疫霉病（Phytophthora capsicum Disease）是由卵菌侵染辣椒引起的土傳病害，其病原菌除危害辣椒外，還可侵染黃瓜、茄子、西瓜、南瓜等作物，對其產(chǎn)量和品質(zhì)構(gòu)成嚴重威脅[1-2]。該病原菌的卵孢子在土壤中存活時間長，能夠侵染的宿主范圍廣，防治難度較大。以往人們大多采用噴灑化學(xué)農(nóng)藥的方法對辣椒疫霉病害進行防控，但此類手段易對環(huán)境與人體健康構(gòu)成威脅[3-6]。隨著綠色農(nóng)業(yè)的興起，生物防控以其環(huán)保、高效等優(yōu)點成為當下土壤病害防治的熱點和必然選擇[7-9]。

固體發(fā)酵是指在沒有或幾乎沒有自由水存在的條件下，以有一定濕度的水不溶性固態(tài)基質(zhì)培養(yǎng)微生物的過程。從生物反應(yīng)過程的本質(zhì)考慮，固體發(fā)酵是以氣相為連續(xù)相的生物反應(yīng)過程，具有操作簡便、能耗低、發(fā)酵過程易控、對無菌要求相對較低、不易發(fā)生大面積污染等優(yōu)點?，F(xiàn)今生產(chǎn)中應(yīng)用的生防活菌劑普遍存在不易保存、活性不穩(wěn)定等問題，而通過固體發(fā)酵生產(chǎn)的菌劑孢子數(shù)量多、活性強、便于保藏和運輸， 并且固體發(fā)酵設(shè)備簡單、成本低廉、易于在生產(chǎn)中應(yīng)用推廣[10-12]。生防型多粘類芽孢桿菌LRS-1是課題組于水稻土壤中篩選獲得的生防菌株，前期試驗已證實了其對辣椒疫霉病害具有顯著的防治效果，開發(fā)利用潛力大[13]。如果將LRS-1菌株進行發(fā)酵并制成生物肥料，將對辣椒疫霉病等的土傳病害防治工作起到有力的促進作用。該研究從固體發(fā)酵基質(zhì)、碳氮源、水分控制、發(fā)酵時間、接種量等方面進行分析與研究，以探明LRS-1固體發(fā)酵的最適條件，同時也研究了LRS-1的熱力抑菌穩(wěn)定性和酸堿抑菌穩(wěn)定性，以探明LRS-1穩(wěn)定抑菌的最適溫度和pH值。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌種 生防型多粘類芽孢桿菌LRS-1：由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院土壤微生物實驗室從水稻土壤中分離、鑒定和保存，并經(jīng)500 μg/mL利福平標記。病原菌：辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）It 263，保存于湖南省植物保護研究所。

1.1.2 發(fā)酵培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基：細菌培養(yǎng)采取NBY培養(yǎng)基（營養(yǎng)肉湯粉8 g/L，酵母提取物2 g/L，磷酸氫二鉀2 g/L， 磷酸二氫鉀0.5 g/L，葡萄糖2.5 g/L，七水合硫酸鎂 1 mol/mL，去離子水配制，瓊脂18 g/L）;真菌培養(yǎng)采用PDA培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，去離子水配制，瓊脂18 g/L）。液體培養(yǎng)時均不添加瓊脂。固體發(fā)酵培養(yǎng)基：以麥麩和草炭為基本基質(zhì)，添加適宜的碳源、氮源和初始含水量進行發(fā)酵。

1.2 試驗方法

1.2.1 生防菌LRS-1種子液的制備 將28℃培養(yǎng)7 d的生防菌LRS-1菌種制成1×106 CFU/mL的菌懸液。取2 mL菌懸液接種于100 mL NBY液體培養(yǎng)基中，于28℃、170 r/min振蕩培養(yǎng)96 h，培養(yǎng)物即為種子液。

1.2.2 生防菌LRS-1固體發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化 （1）基本基質(zhì)配比的優(yōu)化。麥麩與草炭比例共設(shè)置11個處理，分別為50∶0、45∶5、40∶10、35∶15、30∶20、25∶25、20∶30、15∶35、10∶40、5∶45、0∶50。120℃濕熱滅菌30 min，接入LRS-1種子液，每組重復(fù)3次，接種量為5%，28 ℃培養(yǎng)7 d，觀察其生長狀況，然后在含有500 μg/mL利福平的NBY瓊脂培養(yǎng)基上用稀釋平板計數(shù)法測定活菌數(shù)。（2）碳源與氮源的優(yōu)化。碳源為玉米淀粉和大米粉，氮源為小米粉和黃豆粉，各設(shè)置5個處理。碳源添加量分別為4%、8%、12%、16%、20%;氮源添加量分別10%、15%、20%、25%、30%;對照組不添加碳源和氮源。120℃濕熱滅菌30 min，接入LRS-1種子液，每組重復(fù)3次。麥麩與草炭比例為最佳配比，接種量為5%，28 ℃培養(yǎng)7 d，觀察其生長狀況，然后在含有500 μg/mL利福平的NBY瓊脂培養(yǎng)基上用稀釋平板計數(shù)法測定活菌數(shù)。（3）初始含水量的優(yōu)化。初始含水量共設(shè)置6個處理，分別為30%、40%、50%、60%、70%、80%;對照組初始含水量為0。120 ℃濕熱滅菌30 min，接入LRS-1種子液，每組重復(fù)3次。麥麩與草炭比例為最佳配比，接種量為5%，28℃培養(yǎng)7 d，觀察其生長狀況，然后在含有500 μg/mL利福平的NBY瓊脂培養(yǎng)基上用稀釋平板計數(shù)法測定活菌數(shù)。

1.2.3 生防菌LRS-1固體發(fā)酵條件的優(yōu)化 （1）發(fā)酵時間的確定。將搖床培養(yǎng)3 d的種子液以20%（每100 g固體培養(yǎng)基接種20 mL種子液）的接種量接種于優(yōu)化后的固體培養(yǎng)基中，并分裝于器皿中，設(shè)3次重復(fù)，28 ℃靜置培養(yǎng)，分別于第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10天各取樣1次，自然風(fēng)干，粉碎成菌粉，測定含菌量。（2）接種量的確定。取培養(yǎng)3 d的種子液，以5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%的接種量接種于優(yōu)化后的固體培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)9 d后測定固態(tài)發(fā)酵物的含菌量。（3）種子液種齡的確定。分別取搖床培養(yǎng)24、36、48、60、72、84、96、108 h的種子液，以20%的接種量接種于優(yōu)化后的固體培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)9 d后測定固態(tài)發(fā)酵物的含菌量。

1.2.4 生防菌LRS-1抑菌穩(wěn)定性的測定 （1）抑菌熱力穩(wěn)定性的測定。取10份LRS-1菌株液體發(fā)酵液，每份5 mL，裝入無菌封口試管中，分別在30、40、50、60、70、80、90、100 ℃水浴鍋中加熱30 min，對照組不加熱，采用平板對峙法（PDA培養(yǎng)基）與病原菌同時接種，培養(yǎng)7 d后觀察抑菌效果，每個處理重復(fù)3次。（2）抑菌酸堿穩(wěn)定性的測定。取10份LRS-1菌株液體發(fā)酵液，每份5 mL，裝入無菌封口試管中，分別用0.5 mol/L NaCO3和10%磷酸調(diào)節(jié)pH值至3、4、5、6、7、8、9、10，靜置1 h后調(diào)回初始pH值，采用平板對峙法（PDA培養(yǎng)基）與病原菌同時接種，培養(yǎng)7 d后觀察抑菌效果，對照組不調(diào)節(jié)pH值，每個處理重復(fù)3次。

1.3 測定方法

1.3.1 生防菌LRS-1數(shù)量的測定 采用平板計數(shù)法進行LRS-1菌落數(shù)量的測定[14]，試驗中每1 L瓊脂培養(yǎng)基加入10 mL 500 μg /mL的利福平抗生素。

1.3.2 生防菌LRS-1抑菌性測定 采用平板對峙法進行抑菌效果測定[14]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用DPS8.01軟件進行數(shù)據(jù)分析，采用Excel 2010制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 生防菌LRS-1固體發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.1.1 最佳基本基質(zhì)配比 由圖1可以看出，固體發(fā)酵基本基質(zhì)配比（即麥麩與草炭的添加比例）對生防菌LRS-1的數(shù)量有一定的影響，不同配比的固體發(fā)酵基質(zhì)，生防菌LRS-1的數(shù)量也不同。當麥麩與草炭的比例為30∶20時，生防菌LRS-1數(shù)量的lg值最大，為8.90。因此，麥麩與草炭的最佳配比為30∶20。

2.1.2 最佳碳源與氮源 如圖2所示，與對照相比，添加不同種類的碳源均可以促進生防菌LRS-1的生長，說明單純依靠麥麩與草炭的發(fā)酵基質(zhì)不足以滿足生防菌生長的營養(yǎng)需求，需要額外添加碳源。從圖2中還可以看出，當添加12%的大米時，生防菌LRS-1數(shù)量的lg值達到最大，為8.82。因此，宜選用大米作為培養(yǎng)基碳源，其添加量為12%。

如圖3所示，不同種類的氮源對生防菌LRS-1的發(fā)酵影響不同。與對照相比，以小米為氮源的處理組發(fā)酵菌數(shù)均有明顯增加，而以黃豆為氮源的處理組發(fā)酵效果隨添加量的增加由促進逐漸轉(zhuǎn)為抑制。

從圖3中還可以看出，當添加25%的小米時，生防菌LRS-1數(shù)量的lg值達到最大，為8.85。因此，宜選用小米作為培養(yǎng)基氮源，其添加量為25%。

2.1.3 最佳初始含水量 在保證初始含水量不改變固體發(fā)酵基質(zhì)形態(tài)（即只存在極少量自由水）的前提下，試驗設(shè)計了30%～80%的初始含水量處理。從圖4可以看出，與對照相比，當初始含水量低于50%時，活菌數(shù)較低，發(fā)酵受到抑制;隨著初始含水量的繼續(xù)增加，生防菌LRS-1的數(shù)量又明顯地增加，說明此時水分對生防菌的發(fā)酵起主導(dǎo)作用，結(jié)果顯示該試驗條件下80%的初始含水量最適合生防菌LRS-1的固體發(fā)酵。

2.2 生防菌LRS-1固體發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.2.1 發(fā)酵時間的確定 由圖5可以看出，發(fā)酵時間對生防菌LRS-1發(fā)酵的影響與微生物繁殖規(guī)律相符合，即前期呈現(xiàn)出明顯的對數(shù)關(guān)系，而后趨于平緩。發(fā)酵6 d時，生防菌LRS-1數(shù)量的lg值達到最大，為8.70。再繼續(xù)發(fā)酵，其數(shù)量基本保持穩(wěn)定。因此，生防菌LRS-1的最佳發(fā)酵時間應(yīng)為6 d。

2.2.2 接種量的確定 如圖6所示，30%的接種量最適合于生防菌LRS-1的固體發(fā)酵，接種量過低或過高均不利于固體培養(yǎng)。接種量低于30%時，生防菌LRS-1在固體基質(zhì)上生長緩慢，不能深入基質(zhì)內(nèi)部，容易被雜菌污染;而接種量高于30%時，水分過多，嚴重阻礙了菌株的生長。

2.2.3 種子液種齡的確定 如圖7所示，培養(yǎng)72 h的生防菌LRS-1種子液接種效果最好，發(fā)酵物含菌量最大，其l g值達到8.73，說明此階段的菌體生命力旺盛，能迅速適應(yīng)基質(zhì)的固態(tài)環(huán)境。

2.3 生防菌LRS-1抑菌穩(wěn)定性分析

2.3.1 抑菌熱力穩(wěn)定性分析 溫度對菌體的生長和代謝產(chǎn)物生成的影響是非常重要的。一方面影響酶促反應(yīng)的速度，另一方面影響發(fā)酵液的物理性質(zhì)如粘度、基質(zhì)和溶氧情況。因此合理選擇和控制發(fā)酵溫度對生物活性物質(zhì)的產(chǎn)生具有重要意義。發(fā)酵溫度的確定，理論上應(yīng)根據(jù)發(fā)酵過程的不同生理階段而定，但操作難度大。如圖8所示，生防菌LRS-1的抑菌率隨著溫度的升高而降低，30℃時抑菌效果最佳。

2.3.2 抑菌酸堿穩(wěn)定性分析 生防菌的抑菌效果通常受pH值影響較大。如圖9 所示，當pH值<6時，生防菌LRS-1的抑菌效果不甚理想，而在中堿性環(huán)境中，即當pH值>6時，抑菌率>70%，且抑菌效果趨于平穩(wěn)，說明中性及堿性環(huán)境能讓生防菌LRS-1的抑制效果保持穩(wěn)定。

3 結(jié)論與討論

固體發(fā)酵是微生物常用的培養(yǎng)工藝，具有操作簡便，產(chǎn)孢量大，培養(yǎng)物便于存儲、運輸和田間應(yīng)用等特點，而適宜的固態(tài)培養(yǎng)條件是保證菌株高效發(fā)酵的先決條件。接種量是與培養(yǎng)基利用率直接相關(guān)的參數(shù)，接種量大盡管可以使菌株生長快、周期短，但后期可能因缺乏營養(yǎng)而無法實現(xiàn)高的產(chǎn)菌數(shù);而接種量太少不僅對營養(yǎng)利用不充分，而且發(fā)酵周期長，染菌率高。最佳的種液品質(zhì)（種齡）是保證接種的前提。發(fā)酵時間、發(fā)酵載體的碳氮類型及比例、發(fā)酵初始含水量均會影響生防菌株的發(fā)酵效果，這些指標是研判固體發(fā)酵條件的必需參數(shù)。該研究以合適比例的麥麩和草炭作為固體發(fā)酵的基本基質(zhì)，并分別添加適量的大米和小米作為碳源和氮源，篩選了適宜的初始含水量，得到了優(yōu)化的固態(tài)培養(yǎng)基，即：麥麩與草炭的比例為30∶20，大米和小米的添加量分別為12%和25%，初始含水量為80%。該研究還探明了生防型多粘類芽孢桿菌LRS-1的最佳基本發(fā)酵工藝，即接種量為30%、種齡為72 h、發(fā)酵時間為6 d。若要大規(guī)模生產(chǎn)，后期還需進行大型的料箱發(fā)酵試驗。

生防菌株是具有特殊功效的微生物，保障其抑菌遺傳穩(wěn)定性具有重要意義[15-19]。LRS-1的熱力穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性試驗結(jié)果表明LRS-1在30℃左右和中堿性環(huán)境中可以保持穩(wěn)定的抑菌效果。

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（責(zé)任編輯：唐珊珊）