к-卡拉膠和黃原膠復合凝膠及其載藥抗菌性能研究*

劉鵬燕 邢慧敏 徐勝賢 方超友 李秀真 李兆樓Δ

(1濟寧醫(yī)學院臨床醫(yī)學院，濟寧 272013；2濟寧醫(yī)學院基礎醫(yī)學院，濟寧 272067)

к-卡拉膠(к-carrageenan,к-CA)是從紅色海藻中提取的一種天然多糖[1]。由于提取工藝簡單、高效，к-CA這種海洋多糖作為原材料得以大規(guī)模應用。к-CA分子鏈是由β-(1,3)-D-半乳糖-4-硫酸基與α-(1,4)-(3,6-內醚)-D-半乳糖組成的二糖交替共聚物[2]，這條鏈在降溫的水溶液里或加入某種鹽(如KCl)可以完成由雜亂線狀的線圈向有序螺旋的構象變化[3]；通過氫鍵作用或者離子間作用更容易形成雙螺旋結構，實現(xiàn)凝膠化過程。然而，單純к-CA凝膠脆弱且有剛性，并且可能嚴重析出水分[4]。因而，к-CA復合凝膠在科研領域和制藥工業(yè)應用中越來越受關注[4-7]。由于復合凝膠內部不同多糖分子鏈的極性基團影響而發(fā)生協(xié)同作用[8]，極大改善了CA凝膠的性能，如凝膠強度增大等[9]。天然多糖黃原膠(Xanthan gum,XG)，是醫(yī)藥工業(yè)應用價值較高的微生物多糖輔料[10]。它是由油菜黃單孢菌分泌的多糖，分子主鏈由β-(1,4)-D-葡萄糖構成，主鏈每間隔兩個葡萄糖單元就出現(xiàn)一個短的側鏈，其側鏈由相連的三個單糖組成：甘露糖-葡萄糖-甘露糖，其中第一個甘露糖通常被乙?；揎椂B接著主鏈，末端的甘露糖常與丙酮酸發(fā)生縮醛反應而被結合，中間的葡萄糖一般為葡萄糖醛酸的形式[11]。XG分子主鏈可以被側鏈纏繞進而形成有序螺旋，其二級結構可以由兩個單鏈或者一個雙螺旋構成[12]，XG的分子結構特點使它可以充當к-CA凝膠的穩(wěn)定劑。單獨XG水凝膠具有弱凝膠性質，至今沒有用于載藥的報道[13]。而利用к-CA水凝膠進行制劑學研究的報道也不多見[14]。目前關于к-CA和XG的復合凝膠體系研究未見報道。本文研究合成了新型к-CA/XG復合凝膠，觀測了其結構形貌、流變學特性和形成機制等，并應用其制備了左氧氟沙星(levofloxacin,LVFX)新型抗菌制劑。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

Olympus BX51光學顯微鏡；German Zeiss FESEM掃描電子顯微鏡；German Bruker/D8ADVANCE X射線衍射儀；Thermo Haake RS300流變儀；島津IRAffinity-1S傅里葉變換紅外光譜儀；PerkinElmer AAnalyst 800原子吸收光譜儀。

1.2 復合凝膠的制備

稱取0.1754g к-CA和0.0753g XG放入比色管中，然后加蒸餾水6ml，超聲20min，于65℃下恒溫攪拌8h，冷卻到室溫直至凝膠形成，倒置比色管后凝膠不能流動即可。將所得凝膠，置于真空干燥箱內40℃干燥24h，得到干凝膠樣品。

1.3 光學顯微鏡(OM)和電子顯微鏡(SEM)觀察

用OM觀察凝膠樣品結構形貌，并對典型形貌拍照記錄。將干燥所得的干凝膠樣品進行噴金，并用SEM觀察干凝膠結構形貌，得到SEM圖片。

1.4 流變學分析

采用Thermo Haake RS300流變儀堆板系統(tǒng)(直徑35mm，間隙0.105mm)，25℃進行動態(tài)應變掃描，在線性粘彈范圍內對各凝膠樣品掃頻分析。隨機抽取水凝膠樣品，平行測定三次求平均值。

1.5 紅外光譜(FTIR)分析

采用島津IRAffinity-1S傅里葉變換紅外光譜儀，KBr壓片法，得干凝膠樣品的紅外光譜圖。

1.6 X光粉末衍射法(XRD)

將干凝膠樣品置于樣品池，采用German Bruker/D8ADVANCE X射線衍射儀掃描，并記錄譜圖。

1.7 載藥凝膠的制備

首先，使用滅菌蒸餾水配制一定濃度的LVFX溶液，然后分別稀釋成16μg/ml(用于金黃色葡萄球菌)和4μg/ml(用于大腸埃希氏菌)兩種LVFX稀溶液。稱取0.1754g к-CA和0.0753g XG放入比色管中，然后在攪拌下加入6ml LVFX溶液，超聲20min，65℃恒溫攪拌8h，冷卻到室溫直至凝膠形成，倒置比色管后凝膠不能流動即可。所得兩種載藥量不同的凝膠(備用)，可分別用于金黃色葡萄球菌和大腸埃希氏菌的抑菌測試。

1.8 載藥凝膠的抑菌測試

采用自制的牛津杯法測試LVFX載藥凝膠的抑菌效果，模型菌株是金黃色葡萄球菌和大腸埃希氏菌，采用無菌條件下涂布劃線法接種。分別將200μl藥物凝膠和200μl空白對照凝膠注入含有105CFU/ml測試菌液的培養(yǎng)皿，37℃培育24h。通過測量凝膠斑點區(qū)的抑菌圈直徑大小來確定藥物凝膠的抑菌效果，使用與藥物凝膠中同濃度的LVFX溶液做陽性抗菌對照物。所有試驗結果都是三次平行測定的平均值，利用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，方差分析采用Duncan法，P< 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果與討論

2.1 溶膠與凝膠相變過程

在65℃加熱和攪拌8h下，熱к-CA/XG溶膠(圖1a)經過冷卻形成了半透明的復合凝膠(圖1b)；若在к-CA/XG溶膠體系中加入少量LVFX，可以得到載藥凝膠(圖1c)。另一個試驗表明，單獨的к-CA溶膠冷卻后形成凝膠的最低濃度不能低于2.0wt%，這與Iijima等[16]研究結果是一致的。而復合凝膠體系中，我們采用к-CA/XG質量配比7∶3，總濃度4.0wt%，足以形成穩(wěn)定的典型凝膠體系(見1.2部分)。采用65℃加熱條件，能夠使多糖形成線狀的線圈高分子溶液[17]，但過高的溫度不利于所載藥物穩(wěn)定存在。к-CA原料中的KCl含量為K+5.23%，有利于凝膠的形成[18]。試驗表明，所載藥物LVFX不利于凝膠的形成，但16μg/ml的LVFX濃度足以滿足抑菌試驗要求。

圖1 一定條件下к-CA/XG復合凝膠體系的相變過程

2.2 凝膠的微觀形貌

鮮凝膠具有光滑和連續(xù)的表面(圖2a)，無任何裂縫，說明復合凝膠具有一個黏性的基質，兩種多糖分子構筑了持續(xù)穩(wěn)定的混合體系，大量水分子被捕獲和吸附在凝膠網絡中。然而，SEM可以觀察到干凝膠纖維狀紋理為主的多形態(tài)結構(圖2b,c,d)。首先，復合凝膠的表面呈現(xiàn)了一些帶狀和層狀結構(圖2b)，這是去除溶劑水之后所暴露的凝膠真實情況。帶狀結構寬度0.5～1.0μm且長度約3.0μm，它們被黏附在凝膠表層保住水分，也保護內部結構。我們推斷，這可能是兩種多糖分子鏈交織形成的螺旋狀結構的聚集體。從圖2c和圖2d可以更清晰地觀察到不同角度剛性纖維狀的凝膠基質斷面，主要是由к-CA形成的凝膠骨架結構。這是體系在溶膠狀態(tài)下隨機地、以不同膠凝速率進行凝膠化的結果[16]。這些纖維之間的間隙，為裝載藥物分子提供了空間。由于添加的藥物量很小，載藥凝膠的形貌和結構沒有受到影響，依然保持著空白凝膠的結構形貌。

圖2 к-CA/XG復合凝膠的光學顯微鏡與掃描電鏡圖

2.3 凝膠的流變學性質

復合凝膠樣品的流變學測量，按正弦剪切模式提供了儲能模量(G’)和耗能模量(G”)。在頻率掃描測試中(圖3a)，在1Pa的外加應力條件下，復合凝膠樣品的G’和G”值隨著頻率的增加有輕微的增長。因此，某種程度上，該復合凝膠仍呈現(xiàn)出弱凝膠的性質[3]。這可能是由于凝膠中黃原膠側鏈參與影響的結果。但是，在整個頻率掃描過程中，隨著掃描頻率越來越大，G’>G”是保持不變的。這說明復合凝膠中多糖分子鏈被剪切形變釋放的能量更多的轉化并儲存成彈性形變，在黏性流動中損失較少，表現(xiàn)出正常的凝膠特性。在振幅掃描測試過程中(圖3b)，在頻率1Hz下以指數(shù)形式施加應力，復合凝膠結構的應力屈服值只有25Pa左右，這說明黃原膠分子的參與使得復合凝膠成為一個柔軟、富有黏彈性的膠狀網絡結構，這可能更有利于藥物的吸附和控制釋放。

注：a.頻率掃描圖；b.振幅掃描圖

圖3 к-CA/XG復合凝膠的動態(tài)流變圖

2.4 凝膠微結構

復合凝膠內部分子的官能團之間的相互作用情況可以由紅外光譜來反映。首先，3100cm-1～3500cm-1之間的吸收帶歸屬為多糖分子內O-H鍵的伸縮振動吸收(圖4)。復合凝膠干樣品呈現(xiàn)3392cm-1的吸收(圖4a)反映了к-CA/XG混合體系中兩種多糖分子的-OH之間氫鍵作用(圖5)。因為這是к-CA分子O-H鍵的3376cm-1吸收(圖4b)與XG分子O-H鍵的3427cm-1吸收遷移所致[19-20]，即兩個к-CA分子之間O-H氫鍵弱化而к-CA分子與XG分子之間O-H氫鍵增強。此外，XG的原料圖4c中，兩個吸收峰1718cm-1和1419cm-1可歸屬為-COO-基團中C=O的不對稱伸縮振動和C-O對稱振動吸收[21-22]，但在干凝膠樣品吸收中后者發(fā)生紅移至1406cm-1的位置(圖4a)。這很有可能是XG分子中-COO-基團通過K+-離子橋(圖5)與к-CA分子發(fā)生了作用[8,23]。比較圖4a和圖4b，846cm-1吸收峰歸屬為半乳糖-4-硫酸基中糖環(huán)C4-OSO3-鍵的吸收，形成凝膠前后這個C-O鍵的846cm-1吸收未受影響，說明K+-離子橋不會完全通過硫酸基結合[24]，也有可能通過3,6-內醚的氧原子結合(圖5)，甚至部分硫酸基還未被XG分子打擾。因為從к-CA原料(圖4b)到干凝膠(圖4a)，硫酸基中S=O鍵的1157cm-1吸收[25]，以及3,6-內醚的929cm-1吸收[26]，均發(fā)生很小的遷移現(xiàn)象。通過以上分析，我們可以推斷к-CA分子與XG分子之間的作用力，主要是氫鍵作用和K+-離子橋(圖5)，這有助于我們理解兩種多糖分子之間的物理交聯(lián)所形成凝膠的微結構及其形成機制。另外，載藥凝膠中，因為載藥量甚微，藥物分子的紅外吸收峰被凝膠基質掩蓋。

注：a.к-CA/XG復合干凝膠；b.к-CA原料；c.XG原料

圖5 復合凝膠內部к-CA/XG分子之間的氫鍵
作用(虛線)和K+-離子橋(斑點線)示意圖

2.5 X射線粉末衍射(XRD)譜圖

在к-CA原料中，呈現(xiàn)以2θ=20°為中心的一個寬泛峰值，表明к-CA原料是無定形狀態(tài)[27-28]。к-CA原料還有一個明顯的2θ=28.4°尖峰，這是原料中無機鹽KCl晶體的存在，而非卡拉膠本身結構造成的[27-28](圖6a)。形成復合凝膠后，2θ=28.4°的尖峰基本消失了(圖6b)。這說明K+不再以無機鹽形式存在，而是被溶解后參與了兩個多糖分子間的結合位點以形成凝膠。另一個原料XG，也呈現(xiàn)出一個寬泛2θ=21°峰(圖6c)，表明了它的無定形結構[29]。以此為基礎所形成的復合凝膠(圖6b)，也只有一個寬泛2θ=20.2°峰，說明復合凝膠也是無定形結構，并沒有十分有序的新結構形成。

注：a.к-CA原料；b.к-CA/XG復合干凝膠；c.XG原料

圖6 к-CA/XG復合凝膠及其原料的XRD圖譜對比

2.6 載藥凝膠的抗菌測試效果

利用革蘭陽性金黃色葡萄球菌和革蘭陰性大腸埃希氏菌為模型菌株，自制的牛津杯法測試LVFX載藥凝膠的抑菌效果，所得載藥凝膠的斑點區(qū)抑菌圈增長情況拍照如圖7。我們觀察到，無論是對于金黃色葡萄球菌(圖7a)還是對于大腸埃希氏菌(圖7b)，載藥凝膠斑點周圍都出現(xiàn)了十分清晰抑菌圈。而同樣條件下，未加LVFX的空白凝膠斑點周圍則存在密集的細菌菌落。對于金黃色葡萄球菌(圖8a)的作用，載藥凝膠斑點周圍呈現(xiàn)的抑菌圈直徑相對于陽性對照物來說達到50%；對于大腸埃希氏菌(圖8b)的作用，載藥凝膠斑點周圍呈現(xiàn)的抑菌圈直徑相對于陽性對照物的作用達到46%。這些現(xiàn)象表明，к-CA/XG復合凝膠本身沒有抑菌作用，而裝載了LVFX的載藥凝膠直接地表現(xiàn)出抑菌效果。因此，新獲得的к-CA/XG復合凝膠可以應用于抗菌藥物的制劑工業(yè)生產。

注：a. 金黃色葡萄球菌；b. 大腸埃希氏菌；與載藥凝膠中同濃度LVFX溶液作陽性對照，37℃下培育24h

注：a.金黃色葡萄球菌；b.大腸埃希氏菌；陽性對照
為相同濃度LVFX溶液

圖8 к-CA/XG載藥凝膠和空白凝膠抑制菌株
的抑菌圈定量分析

3 結論

利用廉價易得、生物兼容的天然多糖к-CA和XG做原料，可以開發(fā)研究新型的復合凝膠。研究表明，к-CA/XG復合凝膠中兩種多糖分子之間主要以氫鍵和離子橋相結合，形成帶狀或纖維狀紋理的微結構形貌、表現(xiàn)為弱凝膠的流變學特性等。к-CA/XG復合凝膠是一種良好的藥物載體，將к-CA/XG復合凝膠應用于制作抗菌藥物制劑，取得了明顯的抗菌效果。