青海地區(qū)胃腺癌患者TGFβI基因的甲基化狀態(tài)※

趙 琳，王學紅，安 琪，李春霞，王 昀，李蘇華，馬雪芹，郜 茜，綻永華，楊生森，李源化

(青海大學附屬醫(yī)院，青海 西寧 810001)

胃腺癌(Gastric adenocarcinoma)的發(fā)病機制尚不明確，目前認為是由遺傳因素、生物因素和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。遺傳學是腫瘤的研究基礎(chǔ)，隨著對腫瘤機制研究的不斷深入，人們認識到腫瘤基因表達模式的改變不僅包含遺傳學改變而且包含了更多的表觀遺傳學改變，表觀遺傳學改變在腫瘤的啟動和進展中發(fā)揮著比遺傳學更為重要的作用，因此表觀遺傳學的提出為腫瘤研究者帶來了新的思路。表觀遺傳是沒有DNA序列變化的可隨細胞分裂而遺傳的基因組修飾或基因表達調(diào)控，包括DNA甲基化、組蛋白修飾等，這種基因序列不變而基因表達改變的作用機制在多細胞生物的發(fā)育中至關(guān)重要[1]，并能確?；虮磉_發(fā)生在正確的“時間”和“地點”[2]。DNA甲基化已經(jīng)成為表觀遺傳學重要研究內(nèi)容和國內(nèi)外研究的熱點。大量研究揭示了轉(zhuǎn)化生長因子β誘導(dǎo)基因(transforming growth factorβ induced gene，TGFβⅠ)具有為抑癌因子或腫瘤啟動因子的雙重角色作用[3]。青海是我國胃癌高發(fā)區(qū)[4]，其高發(fā)病率的確切機制尚不明確。本研究應(yīng)用MethPrimer在線平臺預(yù)測TGFβⅠ所富含CpG島(共計15個CpG位點)的序列；利用亞硫酸氫鹽測序(bisulfite sequencing PCR，BSP)法，對青海地區(qū)28例胃腺癌患者TGFβⅠ基因啟動子區(qū)的甲基化狀態(tài)進行檢測，初步探討TGFβⅠ基因甲基化與青海地區(qū)胃腺癌發(fā)生的相關(guān)程度。

1.對象及方法

1.1 一般資料

選擇2019年3月至11月期間在青海大學附屬醫(yī)院住院經(jīng)胃鏡及病理首次確診的28例胃腺癌病例為研究對象，收集患者的臨床病理資料，在行胃鏡檢查時取胃腺癌組織、配對癌旁組織樣本各28個；男性18例，女性10例。

1.2 納入標準

①由胃鏡確診的胃癌患者；②在青海生活逾20年者；③未行放化療；④未患有影響本研究結(jié)果的其他疾患；⑤所有研究對象均簽署知情同意書，且通過青海大學附屬醫(yī)院倫理委員會批準(批準文號：XHK-2017-SKJT-001)。

1.3 研究步驟

①胃癌組織及癌旁組織DNA提?。喊碋zup柱式組織基因組DNA抽屜試劑盒(B518251，上海生工)說明書步驟進行。②DNA亞硫酸氫鈉修飾：將各標本的DNA(20μL)依照修飾試劑盒說明書進行。③引物設(shè)計、PCR擴增：應(yīng)用MethPrimer在線平臺預(yù)測TGFβⅠ基因(序列總長度：2040bp)；CpG島預(yù)測結(jié)果：共發(fā)現(xiàn)1個CpG島(長度111bp)，位于1875～1985 bp。其中包含有15個CpG位點。引物由上海生工生物公司設(shè)計，PCR擴增引物序列：上游引物TAAGGGTTGGGAAAATTGAGTA；下游引物CCCRAACCAAATTAAATAAACTAC。PCR反應(yīng)條件：在95 ℃下預(yù)變性3～5 min；在94 ℃下變性30 sec；在55 ℃～60 ℃內(nèi)退火25～30 sec；在72 ℃下延伸30～50 sec，將2～4環(huán)節(jié)做35個循環(huán)；在72 ℃下修復(fù)延伸5～8 min。④電泳檢測條帶：取PCR產(chǎn)物5 μL行1%瓊脂糖凝膠電泳(150V，100mA，10～20min)觀察。⑤連接反應(yīng)體系組成：1 μL10Ligation Buffer，1 μL50%PEG，50 ng pUCmT Vector，0.2 pmolPCR Product，x μLH20，2.5 U T4 DNA Ligase，10 μL Final Volume〔按試劑盒說明書轉(zhuǎn)化步驟制備感受態(tài)細胞(SK9307)〕。⑥ 藍白斑篩選：將IPTG/X-gal平板上的白色菌落在含氨芐青霉素的液體培養(yǎng)基過夜(37℃)。最后采用3%糖凝膠電泳檢測法，對目的片段TA克隆的菌落行PCR鑒定。⑦測序。

1.4 統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)使用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件分析。兩樣本率的比較、分析采用χ2檢驗法或Fisher確切概率法，視P<0.05為有統(tǒng)計學意義。

2.結(jié)果

2.1 胃腺癌患者癌及癌旁組織中TGFβⅠ基因啟動子區(qū)域甲基化狀態(tài)

檢測28例胃腺癌及其配對癌旁組織TGFβⅠ基因啟動子區(qū)域的甲基化狀態(tài)，總克隆8385個CpG位點(胃腺癌組織：4185；癌旁組織：4200)，其中甲基化陽性克隆771個(胃腺癌組織：478個；癌旁組織293個)。癌組織中平均甲基化率為11.42%；配對癌旁組織中平均甲基化率為6.98%，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.001)(表1)。

2.2 TGFβⅠ基因啟動子區(qū)域甲基化與臨床病理特征的關(guān)系

整理28例胃腺癌患者的臨床病理特征資料，進一步分析癌組織中TGFβⅠ基因啟動子甲基化結(jié)果與臨床病理特征之間的關(guān)系。胃腺癌患者癌組織中的TGFβⅠ基因啟動子甲基化率在不同性別、年齡、腫瘤分化程度、浸潤深度、TNM分期患者間未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計學差異(P>0.05)(表2)。

表1 胃腺癌患者癌及癌旁組織中的TGFβⅠ甲基化率

表2 胃腺癌組織TGFβⅠ甲基化狀態(tài)與臨床病理特征的關(guān)系

3.討論

Feinberg和Vogelstein發(fā)現(xiàn)[5]，在腫瘤中同時存在兩個互相矛盾的表觀遺傳現(xiàn)象，即全基因組低甲基化和局部高甲基化。有研究認為[6][7]，全基因組的低甲基化可以導(dǎo)致ras、c-myc等原癌基因激活，而DNA啟動子區(qū)CpG的高甲基化可以導(dǎo)致p16、APC等抑癌基因失活，兩者協(xié)同作用可致腫瘤發(fā)生。TGFβⅠ基因最早是從由TGF-β1刺激的A549肺腺癌細胞中克隆得到的基因，TGFβⅠ基因存在廣泛，它可由多種類型的細胞產(chǎn)生，在人膀胱平滑肌和成纖維細胞中表達[8]，也可以在腎近端小管細胞中表達[9]。作為細胞外基質(zhì)分子之一，最先被關(guān)注的是其調(diào)節(jié)細胞黏附功能和遷移功能。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)TGFβⅠ基因在多種腫瘤中均有表達，但有關(guān)其作用的報道不一致。有研究認為[10]，在腎癌、胰腺癌及結(jié)腸癌中TGFβⅠ基因呈現(xiàn)高表達，并可誘導(dǎo)、增強腫瘤發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的能力；與其相反的是[11][12]，在肺癌、乳腺癌細胞中，TGFβⅠ表達水平明顯下降或表達缺失。DNA甲基化，作為最熱門的表觀遺傳學修飾方式之一，它在細胞生物學中有著十分重要的作用。DNA甲基化是在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMTs)的作用下，于胞嘧啶堿(5-甲基胞嘧啶)的碳-5位置加入一個甲基[13]。研究證明基因的表達結(jié)果會因為DNA甲基化而導(dǎo)致基因沉默致使該基因的表達降低，抑或是DNA甲基化反而導(dǎo)致基因過度表達[3]，而這些過度表達的癌基因可促進腫瘤的發(fā)生[14]。因此，頻繁、連鎖性的DNA高甲基化和DNA低甲基化與腫瘤的產(chǎn)生和腫瘤的進一步發(fā)展可能有著密不可分的關(guān)系。

Han[15]等在對胃癌、肝癌等消化系統(tǒng)腫瘤的研究中用ELISA法測定胃癌患者血清TGFβⅠ水平，得到了患者血清TGFβⅠ水平明顯升高的結(jié)論，考慮異常過量表達的TGFβⅠ基因可能來源于腫瘤本身，且TGFβⅠ基因過表達導(dǎo)致自發(fā)性腫瘤發(fā)生率增加，提示在胃癌中TGFβⅠ基因可能扮演的是“癌基因”角色。同時KiichiSugimoto[16]等收集了原發(fā)性胃癌(primarygastriccancers，PGC)及殘胃癌(remnantgastriccancers，RGC)的病例樣本，對全基因組DNA啟動子進行甲基化分析證實了在基因普遍高甲基化組中PGC的貢獻顯著，表明PGC的啟動子甲基化狀態(tài)高于RGC(P=0.004)，這也進一步闡明了PGC與甲基化的關(guān)系。我們的研究應(yīng)用BSP法，檢測28例胃腺癌患者癌組織及其配對癌旁組織中TGFβⅠ基因啟動子區(qū)域的甲基化狀態(tài)，并與相關(guān)臨床病理資料進行相關(guān)性分析。本研究結(jié)果顯示，胃腺癌患者癌組織中TGFβⅠ基因啟動子甲基化程度明顯高于癌旁組織(P<0.001)。因此我們的研究也得出了與Kiichi Sugimoto一致的研究結(jié)果，提示TGFβⅠ基因在胃癌中可能作為“癌基因”存在，高甲基化會上調(diào)其表達，從而參與胃癌的發(fā)生。Shah[10]、YangkiSeok[11]等的研究結(jié)果認為DNA高甲基化與腫瘤的淋巴轉(zhuǎn)移、局部侵襲呈正相關(guān)；但我們的研究發(fā)現(xiàn)，胃腺癌患者癌組織中TGFβⅠ基因啟動子甲基化率在不同性別、年齡、腫瘤分化程度、浸潤深度、TNM分期患者間不存在統(tǒng)計學差異(P>0.05)。本研究樣本數(shù)有限，需進一步行大樣本研究。

TGFβⅠ基因在胃腺癌中可能為癌基因，其啟動子區(qū)高甲基化狀態(tài)可能與青海胃癌高發(fā)相關(guān)。