紅花瘤果茶種子貯藏特性及萌發(fā)過程中抗氧化酶活性的研究

郭米香1，洪 江，汪建文，劉海燕3，鄒天才

(1.貴州大學(xué)林學(xué)院, 貴陽 550025； 2.貴州科學(xué)院，貴陽 550001； 3.貴州省植物園，貴陽 550004)

紅花瘤果茶(CamelliarubituberculataChang ex Lin et Lu)為貴州特有珍稀瀕危植物，散見于貴州省黔西南州喀斯特山區(qū)常綠落葉闊葉混交林亞喬木層和灌木層中，分布區(qū)狹窄、數(shù)量稀少[1-3]，是山茶屬植物進化發(fā)育保持了原始性狀的類群，果實表面瘤狀突起，木質(zhì)堅硬，樹形優(yōu)美，頗具經(jīng)濟價值[4-5]。了解和掌握其種子的貯藏與萌發(fā)特性，保持種子活力，是開展好紅花瘤果茶物種資源有效保護與合理利用的關(guān)鍵所在。影響種子貯藏壽命的因素包括內(nèi)在因素和外在因素，其中內(nèi)在因素包括種子生物學(xué)特性、含水量、成熟程度，外在因素主要為種子貯藏環(huán)境溫度、濕度等[6]。籽粒飽滿完整的種子萌發(fā)快，幼苗茁壯，貯藏壽命也較長。種子干癟破損，其營養(yǎng)成分被破壞，不耐貯藏，容易腐爛。種子含水量及儲藏的環(huán)境溫度直接影響種子貯藏的活力質(zhì)量，低溫條件貯藏可能會延長或者縮短種子的壽命[6-8]，同時，種子在萌發(fā)過程中的酶需要特定溫度或光照的激活才能賦予其生理作用[9]。因此，研究種子貯藏的適宜條件及種子貯藏物質(zhì)在貯藏過程中的生理特性或生化特征反應(yīng)都可為種子的最佳貯藏方案提供科學(xué)參考，對珍稀瀕危植物的繁育應(yīng)用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 種子采集

2018年11月底，于貴州省晴隆縣紫馬鄉(xiāng)龍頭村上捧碧林區(qū)采集紅花瘤果茶當(dāng)年鮮種子，該林區(qū)為典型的高原亞熱帶濕潤季風(fēng)氣候，巖石裸露60%～80%，海拔1 100～1 150 m，黑色石灰土，pH值7.9～8.2。種子千粒重1 466.60 g，分選除去癟粒和蟲害種子，置于通風(fēng)干燥處備用。

1.2 種子貯藏

挑選出大小均勻的成熟種子，經(jīng)1% KMnO4溶液消毒20 min并清洗，用布袋分裝為5份，于2018年12月1日進行5種不同的貯藏處理。處理1：低溫干燥處理，放于冰箱冷藏室(0～4 ℃)；處理2：干燥冷凍貯藏(-24～-4 ℃)；處理3：室內(nèi)常溫保存(15～25 ℃)；處理4：拌沙冷藏，種子拌濕沙，放于冰箱冷藏室(0～4 ℃)；處理5：拌沙冷凍，種子拌濕沙，放于冰箱冷凍室(-24～-4 ℃)。每30 d取樣檢測其種子脂肪、可溶性蛋白質(zhì)、可溶性糖、含水量和生活力的變化，貯藏120 d后分別檢測各組處理中的種子發(fā)芽率。未經(jīng)貯藏的種子以25粒為1次重復(fù)，設(shè)置3個重復(fù)進行萌發(fā)試驗[10]，種子分別放置于15 ℃、25 ℃、35 ℃的溫度條件下培養(yǎng)，保持每天10 h光照，并于25 ℃恒溫下分別設(shè)置0 h、10 h、24 h等3個光照梯度，分別測定不同溫度和光照處理下種子或幼苗的抗氧化酶活性。

1.3 生理指標(biāo)檢測

種子含水量采用加熱烘干法測定，種子生活力采用TTC染色法測定[10]；蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍G-250染色法[9]；可溶性糖含量采用蒽酮比色法，脂肪含量采用索氏提取法測量[10]。

1.4 種子發(fā)芽指標(biāo)檢測

種子萌發(fā)期間，統(tǒng)計種子發(fā)芽天數(shù)及其發(fā)芽數(shù)量，檢測記錄種子發(fā)芽動態(tài)，一直持續(xù)到種子萌發(fā)結(jié)束為止，3次重復(fù)后求平均值計算其發(fā)芽率和發(fā)芽勢[10]。

1.5 種子萌發(fā)過程中抗氧化酶檢測

未經(jīng)貯藏的種子置于林木種子發(fā)芽盒中，在萌發(fā)過程中每間隔10 d取種子或幼苗，采用可見分光光度法檢測過氧化物酶POD(試劑盒貨號BC 0090；規(guī)格50 T/48 S)和超氧化物歧化酶SOD(試劑盒貨號BC 0170；規(guī)格50 T/24 S)，采用紫外分光光度法檢測過氧化氫酶CAT(試劑盒貨號BC 0200；規(guī)格50 T/48 S)。

1.6 實驗數(shù)據(jù)

采用SPSS 21.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，采用Excel軟件進行圖表處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同貯藏方法對紅花瘤果茶種子含水量及生活力的影響

分別對5種貯藏方法的紅花瘤果茶種子含水量、生活力進行檢測，結(jié)果(圖1)表明，在常溫貯藏、干燥冷藏、干燥冷凍、拌沙冷凍4種儲藏方式下，隨著貯藏時間的增加，種子含水量逐漸降低，下降速率因不同貯藏方式而有差異。種子拌沙冷藏時，貯藏時間0～30 d，種子含水量開始升高，隨后又逐漸下降，下降趨勢不明顯。紅花瘤果茶種子在相同貯藏時間內(nèi)，不同貯藏方式下的種子含水量存在差異。整體來看，拌沙冷藏的種子平均含水量均高于其他4種貯藏方式，常溫貯藏條件下種子含水量最低。紅花瘤果茶種子在貯藏過程中，種子生活力均呈下降的趨勢，貯藏30 d、60 d、90 d時，生活力從高到低依次為拌沙冷藏、干燥冷藏、常溫貯藏、干燥冷凍貯藏、拌沙冷凍貯藏。貯藏120 d后，種子生活力高低依次為拌沙冷藏、常溫貯藏、干燥冷藏、干燥冷凍貯藏、拌沙冷凍貯藏。不同貯藏方式在相同時間節(jié)點下的種子生活力呈現(xiàn)出顯著差異，其中拌沙冷藏處理的種子生活力在貯藏30 d、60 d、90 d、120 d均為最高。貯藏時間0～60 d時，種子生活力下降緩慢，貯藏60 d后，生活力開始急劇下降，甚至拌沙冷凍的紅花瘤果茶種子在貯藏120 d后完全失去活力，種子生活力趨于0。拌沙冷藏條件下的種子生活力最高達30%，常溫貯藏條件下種子生活力為20%，干燥冷藏及干燥冷凍種子生活力分別為18%、10%。

圖1 不同貯藏方法對紅花瘤果茶種子含水量及生活力的影響

2.2 不同貯藏方法對紅花瘤果茶種子營養(yǎng)物質(zhì)含量的影響

2.2.1不同貯藏方法對紅花瘤果茶種子粗脂肪含量的影響

5種貯藏方式下的種子粗脂肪含量均呈下降的趨勢(圖2)，可能是由于種子在貯藏過程中呼吸作用需要消耗脂肪來提供能量。不同貯藏方式下的種子粗脂肪含量由高到低依次為干燥冷藏(7.30%)、常溫貯藏(6.56%)、干燥冷凍(6.34%)、拌沙冷藏(6.15%)、拌沙冷凍(6.01%)，且在5種不同貯藏條件下，紅花瘤果茶種子粗脂肪含量變化均存在差異。

圖2 不同貯藏方法對紅花瘤果茶種子粗脂肪含量的影響

2.2.2不同貯藏方法對紅花瘤果茶種子可溶性蛋白質(zhì)含量的影響

不同儲藏方法對紅花瘤果茶種子可溶性蛋白質(zhì)含量的影響如圖3所示。整體上看，在不同貯藏過程中，可溶性蛋白質(zhì)含量均呈現(xiàn)先升高后下降再升高的波浪式變化，其中可溶性蛋白質(zhì)在0～30 d開始上升，隨后30～90 d持續(xù)下降，在90～120 d又開始上升。其中，拌沙冷凍條件下貯藏0～30 d，可溶性蛋白質(zhì)上升得最多，拌沙冷藏貯藏120 d后，可溶性蛋白質(zhì)含量最高，拌沙冷凍的種子在貯藏120 d后可溶性蛋白質(zhì)含量最低。紅花瘤果茶種子貯藏30 d時，常溫貯藏與拌沙冷藏條件下的種子可溶性蛋白質(zhì)含量無顯著差異，與干燥冷藏、干燥冷凍、拌沙冷凍貯藏條件下的種子可溶性蛋白質(zhì)差異顯著。貯藏60 d及120 d時，種子可溶性蛋白質(zhì)均呈現(xiàn)差異，貯藏90 d時，干燥冷凍和拌沙冷凍貯藏條件下的種子可溶性蛋白質(zhì)差異不顯著，與常溫貯藏、干燥冷藏及拌沙冷藏的差異顯著。

圖3 不同貯藏方法對紅花瘤果茶種子可溶性蛋白質(zhì)含量的影響

2.2.3不同貯藏方法對紅花瘤果茶種子可溶性糖含量的影響

不同貯藏方法對紅花瘤果茶種子可溶性糖含量的影響如圖4所示。隨著貯藏時間的增加，常溫貯藏、干燥冷藏、干燥冷凍、拌沙冷藏、拌沙冷凍條件下的紅花瘤果茶種子可溶性糖均呈升高趨勢。貯藏30 d時，常溫貯藏與拌沙冷藏條件下種子可溶性糖含量差異不顯著，干燥冷藏和拌沙冷凍的種子可溶性糖含量差異不顯著。貯藏60 d，干燥冷藏和拌沙冷藏條件下的種子可溶性糖含量差異不顯著，常溫貯藏和拌沙冷凍貯藏可溶性糖含量差異不顯著。貯藏90 d、120 d時，5種不同貯藏方式下的種子可溶性糖含量均呈現(xiàn)顯著差異。

圖5 溫度和光照對紅花瘤果茶種子萌發(fā)過程中POD活性的影響

圖4 不同貯藏方法對紅花瘤果茶種子可溶性糖含量的影響

2.3 不同貯藏方法對紅花瘤果茶種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢的影響

紅花瘤果茶貯藏120 d后，于2019年4月5日進行萌發(fā)試驗。結(jié)果(表1)表明，紅花瘤果茶種子經(jīng)過貯藏后的劣變程度較大，種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢降低，貯藏120 d后，種子生活力和含水量均下降，完好種子數(shù)量急劇減少。依次進行萌發(fā)試驗，經(jīng)拌沙冷藏120 d的種子含水量、生活力最高，初始發(fā)芽時間也較早，種子發(fā)芽率也最高，但遠低于未經(jīng)貯藏的種子發(fā)芽率。常溫貯藏的紅花瘤果茶種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢依次為8.00%、4.00%，干燥冷藏的種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢皆只為4.00%，主要原因是由于空氣的干燥，種子呼吸作用促使種子營養(yǎng)物質(zhì)消耗增加，剩余的營養(yǎng)物質(zhì)不能支持種子的萌發(fā)。干燥冷凍的種子喪失了發(fā)芽能力，發(fā)芽率趨于0，拌沙冷凍貯藏的種子在貯藏結(jié)束后生活力也趨于0，其原因可能是冰凍導(dǎo)致細胞膜損傷，破壞了種子胚的活力而影響了種子的萌發(fā)。

表1 不同貯藏方法下的紅花瘤果茶種子發(fā)芽基本情況

貯藏方法貯藏結(jié)束含水量/%貯藏結(jié)束生活力/%發(fā)芽率/%發(fā)芽勢/%開始萌發(fā)時間/(年-月-日)常溫貯藏16.3020.008.004.002019-05-26干燥冷藏17.5518.004.004.002019-06-04干燥冷凍21.7710.000.000.00-拌沙冷藏29.6030.0020.0012.002019-05-18拌沙冷凍18.230.00---

2.4 溫度和光照對紅花瘤果茶種子萌發(fā)過程中抗氧化酶活性的影響

2.4.1溫度和光照對種子萌發(fā)過程中POD活性的影響

在不同的溫度和光照條件下，測定種子萌發(fā)過程中POD活性的變化，結(jié)果如圖5所示，25 ℃時，POD活性先升高后降低，在萌發(fā)0～10 d，POD活性上升，但上升速率遠低于15 ℃條件下的，10～50 d，POD活性逐漸下降。在15 ℃條件下，POD活性在萌發(fā)0～10 d急劇上升，并達到一個高峰，隨后在10～20 d急劇下降，在20～50 d又逐漸升高。35 ℃時，POD活性呈現(xiàn)先降低后升高再降低的波浪式變化，萌發(fā)初期0～10 d，POD活性下降到一個最低值，10～20 d又急劇上升，20～30 d開始下降，30～50 d又逐漸上升?？傮w來說，在15 ℃和35 ℃條件下，萌發(fā)后期的POD活性均高于萌發(fā)初期，高溫和低溫條件下，POD活性變化趨勢較明顯。當(dāng)萌發(fā)溫度一定時，不同的光照條件下，種子POD活性也呈現(xiàn)出相應(yīng)的變化規(guī)律。其中0 h、10 h、24 h光照下的種子萌發(fā)過程中POD活性變化趨勢一致，均為先升高，達到一個最高點后開始下降，POD活性的變化規(guī)律與光照長短的關(guān)系不明顯。

2.4.2溫度和光照對種子萌發(fā)過程中SOD活性的影響

SOD的活力與植物的抗逆性密切相關(guān)[20]，在不同的溫度和光照下對紅花瘤果茶種子萌發(fā)過程中SOD活性進行了檢測。結(jié)果(圖6)表明，在15 ℃、25 ℃條件下，種子在萌發(fā)過程中的SOD活性呈現(xiàn)在0～20 d急劇下降，20～30 d上升，30～50 d又開始下降的波浪式變化。35 ℃下，SOD活性在0～10 d上升，10～50 d急劇下降。在15 ℃、25 ℃、35 ℃條件下均能發(fā)芽，說明SOD活性較強，種子內(nèi)部生理活動旺盛，溫度對種子SOD的活性存在影響。光照時間0 h、10 h、24 h條件下，SOD活性受到抑制，均在種子萌發(fā)0～20 d迅速下降，達到最低值，萌發(fā)20～30 d又開始上升，30～50 d再逐漸下降。不同光照條件下的種子SOD活性變化趨勢一致，但在不同萌發(fā)階段的SOD活性具有差異性，但該差異性遠小于溫度對SOD活性變化的影響。

圖7 溫度和光照對紅花瘤果茶種子萌發(fā)過程中CAT活性的影響

2.4.3溫度和光照對種子萌發(fā)過程中CAT活性的影響

CAT能及時清除植物體內(nèi)的有害H2O2，是植物體內(nèi)主要酶促反應(yīng)防御功能物質(zhì)之一[21]。由圖7可見，在3種不同的溫度條件下，相同時間內(nèi)種子CAT活性差異顯著，種子CAT活性隨著溫度的不同，呈現(xiàn)出不同的變化規(guī)律。種子萌發(fā)0～10 d，35 ℃條件下的種子CAT活性最高，其次是15 ℃，25 ℃條件下CAT活性處于一個較低的水平，表明在種子萌發(fā)初期，過高或過低的溫度都能使得CAT活性增強。種子萌發(fā)10～20 d，CAT活性下降，隨后在20～40 d開始上升，最后40～50 d開始下降，萌發(fā)后期，種子發(fā)芽量增加，CAT活性下降。萌發(fā)40～50 d，25 ℃條件下的種子CAT活性高于15 ℃、35 ℃條件下的CAT活性，這也是紅花瘤果茶種子在25 ℃條件下發(fā)芽率高于15 ℃和35 ℃的原因之一。在不同的光照時間下，紅花瘤果茶種子CAT活性變化并未因光照時間不同而呈現(xiàn)明顯差異，且在0 h、10 h、24 h光照下CAT活性變化趨勢趨同，溫度對紅花瘤果茶種子萌發(fā)過程中的CAT活性的影響明顯大于光照時間的影響。

3 結(jié)論與討論

3.1紅花瘤果茶種子適宜拌沙冷藏，種子活力有效貯藏時間小于120 d。拌沙冷藏的種子生活力最高，貯藏60 d時種子生活力達90.00%，貯藏60 d后種子生活力開始斷崖式下降，在120 d時僅有30.00%，種子的含水量和生活力顯著降低，當(dāng)種子含水量下降到臨界含水量以下時，會導(dǎo)致種子活力大幅度降低[11-12]。紅花瘤果茶種子本身是高含水量種子，常溫貯藏60 d后含水量開始下降，120 d后含水量降到最低(16.00%)。試驗還表明，常溫貯藏的紅花瘤果茶種子發(fā)芽率為8.00%，干燥冷藏的種子發(fā)芽率僅有4.00%，干燥冷凍和拌沙冷凍貯藏的種子喪失了發(fā)芽能力，而拌沙冷藏120 d的紅花瘤果茶種子含水量、生活力皆高于其他貯藏方式。因此，選擇拌沙冷藏處理方式，合理調(diào)控種子貯藏時間等在紅花瘤果茶種子育苗生產(chǎn)上具有推廣應(yīng)用的現(xiàn)實意義。

3.2紅花瘤果茶種子內(nèi)含的主要生化物質(zhì)，在不同貯藏環(huán)境中隨著貯藏時間的變化呈現(xiàn)出不同的規(guī)律性變化。研究種子貯藏過程中營養(yǎng)物質(zhì)的變化有利于揭示種子在貯藏過程中的生理變化過程，可為探索種子貯藏方案提供科學(xué)依據(jù)[7]，本試驗5種貯藏方式條件下，紅花瘤果茶種子粗脂肪含量均呈下降趨勢，可溶性蛋白質(zhì)含量均呈現(xiàn)先升高后下降再升高的波浪式反復(fù)規(guī)律，在貯藏時間為30～90 d時可溶性蛋白質(zhì)含量急劇下降，貯藏90～120 d時可溶性蛋白質(zhì)又開始升高，隨著貯藏時間的增加，紅花瘤果茶種子可溶性糖均呈現(xiàn)升高趨勢?，F(xiàn)代生物學(xué)研究表明，在種子貯藏過程中脂肪、可溶性蛋白質(zhì)、可溶性糖之間可以相互轉(zhuǎn)化，脂肪含量降低，相應(yīng)的可溶性糖含量升高，糖是植物種子呼吸代謝的基質(zhì)，可溶性糖含量升高[13-16]；紅花瘤果茶種子呼吸作用加強，種子加速其生理代謝，這將影響種子貯藏的質(zhì)量和種子的生活力。

3.3不同溫度和光照條件下，紅花瘤果茶種子萌發(fā)過程中的氧化酶活性呈現(xiàn)出規(guī)律性變化。試驗表明：

1) 較高或較低溫度條件下，紅花瘤果茶種子的POD活性變化趨勢較明顯。種子在較高或較低的溫度條件下萌發(fā)，抗氧化酶促反應(yīng)的活性降低，種子萌發(fā)到特定階段，氧化酶活性又開始恢復(fù)并保持著生理平衡。

2) 紅花瘤果茶種子在15、25、35 ℃條件下均能發(fā)芽，3個溫度梯度條件下的SOD均有活性，在萌發(fā)后期，35 ℃條件下的SOD活性低于15 ℃、25 ℃，表明溫度偏高將會導(dǎo)致SOD活性降低，從而影響種子的萌發(fā)出苗。

3) 紅花瘤果茶種子CAT活性隨著環(huán)境溫度的不同，呈現(xiàn)出不同的變化規(guī)律。種子萌發(fā)0～10 d，35 ℃條件下的種子CAT活性最高，15 ℃次之、25 ℃再次之，說明在種子萌發(fā)初期，較高或者較低的溫度都能使得CAT活性增強。但在萌發(fā)后期(40～50 d)，25 ℃條件下的種子CAT活性明顯高于15 ℃和35 ℃，也是紅花瘤果茶種子在25 ℃條件下發(fā)芽率高于15 ℃和35 ℃的原因之一。

4) 在不同光照時間下，紅花瘤果茶種子萌發(fā)過程中POD、SOD、CAT的變化趨勢并未隨著光照時間的變化而發(fā)生變化，光照時間的長短對紅花瘤果茶種子萌發(fā)過程中的抗氧化酶變化的影響不明顯。已有研究證實，當(dāng)植物種子在萌發(fā)過程中受到環(huán)境脅迫時，產(chǎn)生的活性氧需要抗氧化系統(tǒng)來免疫清除，POD、SOD、CAT等發(fā)生生理功能作用，維持細胞自由基的低水平狀態(tài)和保護細胞膜不受損傷，以維持細胞內(nèi)活性氧處于一個較安全的水平[18-22]。紅花瘤果茶的種子也不例外，研究掌握種子貯藏過程中的生理生化特性，探索其種子萌發(fā)過程中抗氧化酶變化規(guī)律等具有重要科學(xué)意義和生產(chǎn)應(yīng)用價值。