不同鹽度對(duì)生物絮團(tuán)、對(duì)蝦生長(zhǎng)以及酶活性的影響

秦海鵬，楊世平，王 博，廖栩崢，胡世康，趙吉臣，何子豪，孫成波

( 廣東海洋大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，廣東 湛江 524088 )

目前，水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)正在走向高密度集約化、工廠化的養(yǎng)殖模式，在此模式下，養(yǎng)殖水體水質(zhì)嚴(yán)重惡化，危害養(yǎng)殖對(duì)蝦的健康，同時(shí)高密度養(yǎng)殖病害暴發(fā)日益頻繁，養(yǎng)殖廢水的排放對(duì)生態(tài)環(huán)境也造成了嚴(yán)重污染[1]。生物絮凝技術(shù)由以色列專家首先應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)之后，已經(jīng)在調(diào)控水質(zhì)、切斷水產(chǎn)病害傳播等方面展現(xiàn)出了巨大優(yōu)勢(shì)，已成為行業(yè)研究的熱點(diǎn)[2]，生物絮體的核心是菌膠團(tuán)細(xì)菌和絲狀細(xì)菌，它們通過分泌的胞內(nèi)和胞外聚合產(chǎn)物等, 將異養(yǎng)細(xì)菌、硝化細(xì)菌、真菌、藻類、原生動(dòng)物、有機(jī)聚合體、膠體、陽(yáng)離子和碎屑等黏附在一起，形成結(jié)構(gòu)多樣化的絮狀物[3-4]。生物絮團(tuán)可以通過微生物的同化作用和硝化作用有效去除水體中的氨氮、亞硝態(tài)氮，實(shí)現(xiàn)水質(zhì)的凈化[5-6]。

凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)為廣鹽性海水蝦類，近年來(lái)在淡水、半咸水和海水中都進(jìn)行了大規(guī)模養(yǎng)殖。目前，關(guān)于鹽度對(duì)蝦類生物絮團(tuán)養(yǎng)殖影響的研究主要集中于鹽度突變方面[7],而鹽度對(duì)凡納濱對(duì)蝦影響的研究主要集中于凡納濱對(duì)蝦生存、生長(zhǎng)、能量收支和滲透壓調(diào)節(jié)等方面[8-11]。已有研究表明，生物絮團(tuán)水體中氮元素的循環(huán)受到鹽度的影響；生物絮團(tuán)中的生物類群和組成結(jié)構(gòu)，也受到鹽度的影響，從而影響到對(duì)蝦養(yǎng)殖水體的水質(zhì)、對(duì)蝦生長(zhǎng)和代謝等[12]。但鹽度對(duì)凡納濱對(duì)蝦生物絮團(tuán)長(zhǎng)周期養(yǎng)殖的影響尚未見相關(guān)報(bào)道。筆者在不同鹽度下進(jìn)行凡納濱對(duì)蝦的生物絮團(tuán)養(yǎng)殖試驗(yàn)，旨在探究不同鹽度對(duì)凡納濱對(duì)蝦生理因子的影響，以及生物絮團(tuán)在不同鹽度下氮元素轉(zhuǎn)化的規(guī)律，探究生物絮團(tuán)養(yǎng)殖凡納濱對(duì)蝦的適宜鹽度，為凡納濱對(duì)蝦生物絮團(tuán)海水養(yǎng)殖模式的推廣提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地點(diǎn)

廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院東海島海洋生物研究基地。

1.2 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)在設(shè)有防逃網(wǎng)的0.3 m3的藍(lán)色塑料桶中進(jìn)行，用曝氣處理后的自來(lái)水稀釋消毒海水來(lái)調(diào)節(jié)鹽度，用200目的篩絹網(wǎng)將生物絮團(tuán)自養(yǎng)殖池中撈取至調(diào)配好鹽度的海水中。凡納濱對(duì)蝦在不同鹽度組內(nèi)經(jīng)過7 d的適應(yīng)期，體長(zhǎng)(7.7±0.63) cm、體質(zhì)量(6.15±1.15) g。

1.3 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)設(shè)置5個(gè)鹽度梯度：10、15、20、25、30，每個(gè)梯度3個(gè)平行，飼養(yǎng)密度為500 尾/m3，生物絮團(tuán)初始量為20 mL/L，試驗(yàn)周期30 d。試驗(yàn)過程中24 h連續(xù)充氣。試驗(yàn)從第15 d起每日添加5 mg/L的碳酸氫鈉來(lái)調(diào)節(jié)pH和總堿度。

1.4 水質(zhì)和生長(zhǎng)指標(biāo)

試驗(yàn)期間，每5 d測(cè)定一次總堿度、pH、硝態(tài)氮、亞硝態(tài)氮、氨氮。在試驗(yàn)開始和試驗(yàn)結(jié)束時(shí)測(cè)定對(duì)蝦的體長(zhǎng)和體質(zhì)量。

氨氮的測(cè)定采用靛酚藍(lán)分光光度法；硝態(tài)氮的測(cè)定采用鋅—鎘還原分光光度法；亞硝態(tài)氮的測(cè)定采用鹽酸萘乙二胺分光光度法；總堿度的測(cè)定采用酸堿滴定法[13]。

1.5 消化和免疫指標(biāo)測(cè)定

試驗(yàn)結(jié)束時(shí)進(jìn)行取樣，取樣時(shí)隨機(jī)挑選處于蛻殼間期的對(duì)蝦。取其肝胰臟、肌肉組織分別放入樣品管中，準(zhǔn)確稱量質(zhì)量后迅速投入液氮冷凍，再轉(zhuǎn)移到冰箱-80 ℃保存，以上操作均在冰盤中進(jìn)行。取保存的組織樣品，加入9倍體積預(yù)冷的對(duì)蝦生理鹽水，在冰浴中研磨勻漿，然后4 ℃，5000 r/min離心10 min，取上清液用于對(duì)蝦消化和非特異性免疫指標(biāo)的測(cè)定。所有酶活力及蛋白含量的測(cè)定均采用南京建成生物研究所研制的檢測(cè)試劑盒，按照操作步驟進(jìn)行操作。

1.6 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)采用Excel 2016軟件統(tǒng)計(jì)分析，用SPSS 19.0軟件在0.05水平上進(jìn)行顯著性差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同鹽度下凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)指標(biāo)的差異

凡納濱對(duì)蝦在20鹽度組鹽度下體長(zhǎng)的增長(zhǎng)率最大，為20.00%，凈增體長(zhǎng)1.54 cm，15鹽度組體長(zhǎng)增長(zhǎng)率最小，為15.58%，凈增體長(zhǎng)1.20 cm，達(dá)15.58%。各鹽度下終末體長(zhǎng)差異不顯著(P>0.05)。20鹽度組和25鹽度組的對(duì)蝦質(zhì)量的增長(zhǎng)率最大，為70.73%，凈增質(zhì)量4.35 g，15鹽度組的體質(zhì)量增長(zhǎng)率最小，體質(zhì)量增長(zhǎng)3.09 g，達(dá)50.24%，各鹽度間差異不顯著(圖1)(P>0.05)。

圖1 不同鹽度下凡納濱對(duì)蝦終末體長(zhǎng)和體質(zhì)量的差異

2.2 不同鹽度下生物絮團(tuán)沉降量的變化

鹽度越高生物絮團(tuán)生長(zhǎng)越快，30鹽度組的生物絮團(tuán)沉降量在第17 d達(dá)到最大值，為200 mL/L，隨后逐漸降至43 mL/L，其他各鹽度組呈相同變化趨勢(shì)(圖2)。第30 d各鹽度絮團(tuán)沉降量差異不顯著(P>0.05)。

圖2 不同鹽度下生物絮團(tuán)沉降量的變化

2.3 不同鹽度下pH與總堿度的變化

試驗(yàn)各鹽度組的pH持續(xù)降低，鹽度越低，pH降低越快，15鹽度組pH最低為7.36，15鹽度組在第11 d與20鹽度組、25鹽度組和30鹽度組差異顯著(P<0.05)，20鹽度組與25鹽度組、30鹽度組差異顯著(P<0.05)(圖3)。各鹽度組的總堿度持續(xù)降低，鹽度越低，總堿度降低越快，15鹽度組總堿度最低，達(dá)43 mg/L(以CaCO3計(jì))(圖4)，10、15鹽度組在第11 d與20、25、30鹽度組差異顯著(P<0.05)。

圖3 不同鹽度下pH的變化

圖4 不同鹽度下總堿度的變化

2.4 不同鹽度下氨氮的變化

氨氮在30鹽度組積累的最快，在第6 d達(dá)到最大質(zhì)量濃度8.62 mg/L后，在全部試驗(yàn)周期中持續(xù)降低，在第21 d降至0 mg/L，10鹽度組積累的最慢，也在第6 d達(dá)到最大質(zhì)量濃度1.71 mg/L，隨后在第21 d降至0 mg/L，其他鹽度組呈相同趨勢(shì)變化(圖5)。在第6 d各鹽度組之間氨氮質(zhì)量濃度差異不顯著(P>0.05)。

圖5 不同鹽度下氨氮質(zhì)量濃度的變化

2.5 不同鹽度下亞硝態(tài)氮的變化

亞硝態(tài)氮在10鹽度組積累的最快，在第6 d達(dá)到最大質(zhì)量濃度9.18 mg/L，隨后在全部試驗(yàn)周期中持續(xù)降低，在第16 d降至0 mg/L，30鹽度組積累的最慢，也在第6 d達(dá)到最大質(zhì)量濃度5.79 mg/L，隨后在第16 d降至0 mg/L，其他各鹽度組呈相同變化趨勢(shì)(圖6)。30鹽度組的亞硝態(tài)氮濃度質(zhì)量在第6 d顯著高于10、15、20鹽度組，25鹽度組亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度顯著高于10鹽度組和15鹽度組，10、15、20鹽度組之間差異不顯著(P>0.05)。

圖6 不同鹽度下亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度的變化

2.6 不同鹽度下硝態(tài)氮的變化

試驗(yàn)由第1 d開始到第16 d硝態(tài)氮在不同鹽度中呈上升的趨勢(shì)，試驗(yàn)前6 d硝態(tài)氮的累積為鹽度越低硝態(tài)氮質(zhì)量濃度越高，10鹽度組在第6 d硝態(tài)氮質(zhì)量濃度達(dá)到最大值，為15.75 mg/L，第16 d鹽度越高硝態(tài)氮質(zhì)量濃度越高，30鹽度組在第30 d硝態(tài)氮質(zhì)量濃度達(dá)到最大值，為58.39 mg/L，隨后開始降低，最低達(dá)28.63 mg/L(圖7)。

圖7 不同鹽度下硝態(tài)氮質(zhì)量濃度的變化

2.7 鹽度對(duì)凡納濱對(duì)蝦消化指標(biāo)的影響

低鹽度與高鹽度肝胰臟脂肪酶活性較高，25、30鹽度組的脂肪酶活性最高，達(dá)1.21 U/mg，顯著高于15、20鹽度組的活性，10鹽度組脂肪酶活性也高于15、20鹽度組的活性，但差異不顯著(P>0.05)(圖8)。15鹽度組的淀粉酶活性顯著高于其他鹽度組(P<0.05)，其他各鹽度組間差異不顯著(P>0.05)(圖9)。

2.8 鹽度對(duì)凡納濱對(duì)蝦超氧化物歧化酶的影響

20、25鹽度組肌肉中的超氧化物歧化酶活性顯著高于其他鹽度組(P<0.05)，20鹽度組的酶活性最高，此外10鹽度組的酶活性也較高，30鹽度組的酶活性最低(圖10)。肝胰臟中各鹽度組酶活性差異不顯著(P>0.05)，肝胰臟與肌肉中超氧化物歧化酶活性在不同鹽度下的規(guī)律相似，即先降后升再降。

圖8 鹽度對(duì)凡納濱對(duì)蝦脂肪酶活性的影響

圖9 鹽度對(duì)凡納濱對(duì)蝦淀粉酶活性的影響

圖10 鹽度對(duì)凡納濱對(duì)蝦超氧化物歧化酶活性的影響

2.9 鹽度對(duì)凡納濱對(duì)蝦過氧化氫酶的影響

30鹽度組肌肉中的過氧化氫酶活性顯著高于其他各鹽度組，其他各鹽度組差異不顯著(P>0.05)(圖11)。肝胰臟與肌肉中過氧化氫酶活性的規(guī)律接近，30鹽度組的活性也顯著高于其他各鹽度組，25鹽度組的活性低于其他各鹽度組。相同鹽度下，肌肉中過氧化氫酶的活性低于在肝胰臟中的活性。

圖11 鹽度對(duì)凡納濱對(duì)蝦過氧化氫酶活性的影響

2.10 鹽度對(duì)凡納濱對(duì)蝦堿性磷酸酶的影響

堿性磷酸酶在肌肉中的活性極低，20鹽度組的活性高于其他各鹽度組，但各組間差異不顯著(P>0.05)，堿性磷酸酶活性在不同鹽度下的規(guī)律先升后降(圖12)。肝胰臟中，堿性磷酸酶的活性在20鹽度組中最高，20、30鹽度組活性差異顯著(P<0.05)，20鹽度組與其他各組鹽度差異不顯著(P>0.05)。肝胰臟中堿性磷酸酶活性在不同鹽度下的規(guī)律為先降后升再降。

2.11 鹽度對(duì)凡納濱對(duì)蝦酸性磷酸酶的影響

酸性磷酸酶在肌肉中的活性很低，20鹽度組的活性高于其他各鹽度組且差異顯著(P<0.05)，30鹽度組的活性顯著低于其他各鹽度組(P<0.05)，酸性磷酸酶活性在不同鹽度下的規(guī)律為先升后降。肝胰臟中，酸性磷酸酶的活性在20鹽度組中最高，20鹽度組與其他各鹽度組活性差異顯著(P<0.05)，10鹽度組顯著低于其他各鹽度組(P<0.05)(圖13)。肝胰臟堿性磷酸酶活性與肌肉的規(guī)律相同，即隨著鹽度升高酶活性先升再降。

圖12 鹽度對(duì)凡納濱對(duì)蝦堿性磷酸酶活性的影響

圖13 鹽度對(duì)凡納濱對(duì)蝦酸性磷酸酶活性的影響

3 討 論

3.1 不同鹽度下凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)指標(biāo)的差異

鹽度是海洋無(wú)脊椎動(dòng)物生存、生長(zhǎng)發(fā)育的重要影響因子, 鹽度變化直接影響動(dòng)物體內(nèi)滲透壓和離子濃度的調(diào)節(jié)[14]。已有的研究表明,凡納濱對(duì)蝦等廣鹽性蝦類可通過自身的滲透壓離子調(diào)節(jié)來(lái)適應(yīng)水體的不同鹽度，水體鹽度較高時(shí),蝦類排除體內(nèi)的多余鹽分，同時(shí)增加對(duì)水分的吸收；在鹽度較低時(shí)又從水體中吸收鹽分，并排出多余的水分，來(lái)實(shí)現(xiàn)自身與環(huán)境的滲透壓平衡。在這個(gè)過程中,蝦類要消耗大量的能量，同時(shí)蝦類的生長(zhǎng)也會(huì)受到影響[15]。而在處于等滲點(diǎn)的環(huán)境時(shí)消耗能量少，用于生長(zhǎng)的能量比最大[16]。凡納濱對(duì)蝦最適宜鹽度的研究結(jié)果不盡相同，不同試驗(yàn)條件下，凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)的最適鹽度分別為4～8[17]、2～8[18]、20[9-10]和30[19]。本試驗(yàn)中，鹽度15和20的條件下，凡納濱對(duì)蝦的生長(zhǎng)速度最快?？梢缘贸觯谏镄鯃F(tuán)模式下凡納濱對(duì)蝦的最適生長(zhǎng)鹽度為15～20。

3.2 不同鹽度下pH、總堿度和生物絮團(tuán)結(jié)構(gòu)的變化

本試驗(yàn)的結(jié)果顯示，生物絮團(tuán)對(duì)鹽度有廣泛的適應(yīng)性，鹽度越高生物絮團(tuán)生長(zhǎng)越快。試驗(yàn)所用生物絮團(tuán)來(lái)源于鹽度約30的養(yǎng)殖池中，在與原環(huán)境鹽度相同的30鹽度組水體中絮團(tuán)生長(zhǎng)速度最快，但是不同鹽度下絮團(tuán)的演替周期和轉(zhuǎn)化氮元素的周期相同，在時(shí)間上保持同步。

生物絮團(tuán)在生長(zhǎng)過程中需要消耗水體中的堿度并產(chǎn)生大量的二氧化碳，使水體pH和總堿度降低，與Ebeling等[20]的研究結(jié)果相似。已有研究表明，在生物絮團(tuán)養(yǎng)殖系統(tǒng)中，堿度降至低于100 mg/L、pH降至低于7.0時(shí)會(huì)對(duì)對(duì)蝦的健康產(chǎn)生影響[21]。同時(shí)，較高的堿度可對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖絮體生物學(xué)特性及氨氮轉(zhuǎn)化產(chǎn)生影響[22]。因此在試驗(yàn)過程中需要給水體中持續(xù)添加碳酸氫鈉或者氧化鈣等來(lái)維持pH和總堿度。

3.3 不同鹽度下生物絮團(tuán)養(yǎng)殖水體中氮元素的轉(zhuǎn)化

本試驗(yàn)中，鹽度越高氨氮累積越快，鹽度越低亞硝態(tài)氮累積越快。不同鹽度下硝態(tài)氮的累積趨勢(shì)類似， 25、30鹽度組的硝態(tài)氮質(zhì)量濃度自21 d起開始呈降低的趨勢(shì)。

生物絮團(tuán)養(yǎng)殖水體中碳氮比在15以上時(shí)，以異養(yǎng)的方式將水體中的三態(tài)氮轉(zhuǎn)化為自身的菌體蛋白；在碳氮比低于5時(shí)主要依靠硝化作用清除無(wú)機(jī)氮[23]。本次試驗(yàn)中的生物絮團(tuán)通過硝化途徑來(lái)處理水體中的氮元素。生物絮團(tuán)中的亞硝化細(xì)菌將氨氮轉(zhuǎn)化為亞硝態(tài)氮，硝化細(xì)菌把亞硝態(tài)氮轉(zhuǎn)化為硝態(tài)氮，伴隨著硝態(tài)氮質(zhì)量濃度的增加。這與Avnimelech[5]的研究結(jié)果相似，對(duì)于試驗(yàn)后期硝態(tài)氮質(zhì)量濃度的降低，初步分析有兩種原因：一是反硝化細(xì)菌逐漸繁殖增加，將硝態(tài)氮進(jìn)一步轉(zhuǎn)化掉[24]；二是生物絮團(tuán)在試驗(yàn)后期由自養(yǎng)型微生物群落結(jié)構(gòu)向異養(yǎng)型的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化，可直接將氮元素轉(zhuǎn)化為自身的有機(jī)氮，不需要通過硝化途徑的無(wú)機(jī)氮循環(huán)來(lái)處理水體中的氮元素[25]。水體中的細(xì)菌在繁殖過程中，不僅可以穩(wěn)定水質(zhì)，還可以增加凡納濱對(duì)蝦腸道菌群的組成豐度[26]。

3.4 不同鹽度對(duì)凡納濱對(duì)蝦酶活性的影響

鹽度是對(duì)蝦養(yǎng)殖中重要的環(huán)境因子之一，鹽度會(huì)直接影響對(duì)蝦的生長(zhǎng)、存活、滲透壓調(diào)節(jié)、免疫和代謝酶活性等[9,27]。試驗(yàn)中淀粉酶的活性隨著鹽度的升高呈先升后降的趨勢(shì)，這與侯文杰等[28]的結(jié)果相同。同時(shí)黃凱等[9]發(fā)現(xiàn)，低鹽度組的凡納濱對(duì)蝦淀粉酶、蛋白酶活性均高于高鹽度組，認(rèn)為可能是低鹽度組維持滲透壓平衡需要消耗更多的能量，因此需要更高的淀粉酶活性用于消化食物。脂肪酶在鹽度25時(shí)活性最高，鹽度升高或者降低酶活性均隨之降低。凡納濱對(duì)蝦在鹽度為15～25時(shí)，超氧化物歧化酶、堿性磷酸酶、酸性磷酸酶活性均維持在較高水平，與沈麗瓊等[29]的研究結(jié)果相一致。消化酶與免疫酶活性的強(qiáng)弱決定了凡納濱對(duì)蝦對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的能力以及機(jī)體的免疫能力[30]，在鹽度15～25間較高的酶活性也表明了凡納濱對(duì)蝦的適宜鹽度，與朱春華[31]的研究結(jié)果相一致。

4 結(jié) 論

生物絮團(tuán)是一種零換水的養(yǎng)殖技術(shù)，在解決水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境污染，減少病害的暴發(fā)，阻絕病害的傳播等方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，因此開展生物絮團(tuán)在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用研究，具有極大的意義。

本試驗(yàn)的結(jié)果表明，在生物絮團(tuán)模式下，凡納濱對(duì)蝦的最適生長(zhǎng)鹽度為15～20。養(yǎng)殖水體中不同鹽度下氨氮和亞硝態(tài)氮的累計(jì)速度有差異，試驗(yàn)前期鹽度越高氨氮累積越快，鹽度越低亞硝態(tài)氮累積越快，此外生物絮團(tuán)對(duì)鹽度有廣泛的適應(yīng)性，不同鹽度下絮團(tuán)的演替周期和轉(zhuǎn)化氮元素的周期相同，在時(shí)間上保持同步。值得注意的是，在生物絮團(tuán)模式下，水體中的氮元素通過硝化途徑進(jìn)行轉(zhuǎn)化，會(huì)消耗水體中的堿度并產(chǎn)生大量的二氧化碳，使水體pH和總堿度降低，因此在生物絮團(tuán)養(yǎng)殖模式下，需要添加一定量的碳酸氫鈉、氧化鈣等藥品來(lái)調(diào)節(jié)水質(zhì)。