Fru-Gly化合物的合成條件優(yōu)化及其抗氧化活性

宋瑩蕾 萬 茵* 付桂明，3 郭 嵐

（1 南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 南昌330047 2 南昌大學(xué)食品學(xué)院 南昌330031 3 南昌大學(xué)中德食品工程中心 南昌330047 4 南昌大學(xué)分析測試中心 南昌330047）

1-氨基-1-脫氧-2-酮糖又名Amadori 化合物，是美拉德反應(yīng)初期階段形成的關(guān)鍵中間體。該物質(zhì)是由N-取代葡萄糖胺經(jīng)Amadori 重排而來，在其形成階段不產(chǎn)生香氣，是重要的非揮發(fā)性香味前體物[1]，對(duì)食品的風(fēng)味、色澤及營養(yǎng)價(jià)值具有重要作用。

近年來關(guān)于Amadori 化合物的研究主要集中于煙草行業(yè)[2-4]，有關(guān)食品中Amadori 化合物的研究也逐漸增多，比如Yuan 等[5-6]利用液-質(zhì)譜聯(lián)用法同時(shí)測定葡萄干、新鮮大蒜和黑蒜中Amadori化合物及Heyns 化合物的含量；Katayama H 等[7]同時(shí)測定了醬油中的20 種Amadori 化合物。目前，用于測定Amadori 化合物含量的方法主要包括高效陰離子色譜串聯(lián)脈沖安培檢測器法[8]、高效陰離子色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[9]及高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[10]。

近年來，美拉德反應(yīng)產(chǎn)物（Maillard reaction products，MRPs）的抗氧化活性一直是研究的熱點(diǎn)[11-12]。有研究報(bào)道，美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中，尤其是中間產(chǎn)物還原酮、類黑精以及其它一些衍生物，不僅對(duì)食品的風(fēng)味、色澤，營養(yǎng)價(jià)值和穩(wěn)定性具有重要影響，而且具有較強(qiáng)的抗氧化活性[13-14]。然而，對(duì)于美拉德反應(yīng)初期階段形成的Amadori 化合物的抗氧化活性的研究不多。如Koch[15]研究發(fā)現(xiàn)番茄制品中的1-脫氧-1-L-組氨酸-D-果糖（Fructose-Histidine，F(xiàn)ru-His）具有抗氧化活性，它與番茄紅素相互作用可以降低前列腺癌的風(fēng)險(xiǎn)。劉麗敏[16]人工合成紅參中精氨酸單糖苷（Fructose L-Arginine，F(xiàn)ru-Arg）并對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)Fru-Arg 具有一定的DPPH 自由基清除能力。肜霖[17]研究發(fā)現(xiàn)1-脫氧-1-L-丙氨酸-D-果糖、1-脫氧-1-L-纈氨酸-D-果糖和1-脫氧-1-L-脯氨酸-D-果糖具有抗氧化活性。Mossine 等[18]研究發(fā)現(xiàn)Fru-His 具有潛在的抗氧化活性。目前對(duì)于Fru-Gly 化合物抗氧化活性的研究仍處于空白。

目前Amadori 化合物的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)品難以獲得并且價(jià)格昂貴，利用UPLC-TOF MS-MS 法檢測其生成量，從而對(duì)其合成工藝進(jìn)行優(yōu)化的試驗(yàn)成本較高。為降低成本，本文利用UPLC-TOF MSMS 法測定不同反應(yīng)條件下葡萄糖和甘氨酸反應(yīng)合成Fru-Gly 化合物的濃度，并對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行測定，以說明Fru-Gly 化合物具有一定的抗氧化活性。由相關(guān)性分析說明其濃度與DPPH、ABTS、還原力法測定的抗氧化能力的相關(guān)性，為Amadori 化合物的合成工藝優(yōu)化和美拉德反應(yīng)產(chǎn)物研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Fru-Gly 化合物，加拿大TRC 試劑公司；Amberlite IR-120H+陽離子交換樹脂、DPPH、ABTS、甲醇（色譜純），美國Sigma 公司；乙腈（色譜純），百靈威科技有限公司；甲酸（色譜級(jí)），上海安譜科學(xué)儀器有限公司；葡萄糖，阿拉丁試劑有限公司；甘氨酸、鹽酸、氯化鈉、氨水、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵，均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

TripleTOF 5600+ LC-TOF MS-MS，美國AB Sciex 公司；Shim-pack GIST C18（2.1 mm×75 mm，2 μm）液相色譜柱，日本島津；HH-6 數(shù)顯恒溫?cái)嚢杷″?，金壇市城東新瑞儀器廠；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；TU-1900 雙光束紫外分光光度計(jì)，北京普析通用電器有限責(zé)任公司。

1.3 方法

1.3.1 Fru-Gly 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 精密稱取Fru-Gly 標(biāo)準(zhǔn)品0.0050 g，置于10 mL 容量瓶中，用蒸餾水溶解并定容，配制成500 μg/mL 的貯存液。準(zhǔn)確吸取0.1 mL 貯存液于50 mL 容量瓶并定容，配成質(zhì)量濃度為2 μg/mL 的母液。依次稀釋母液，得到系列標(biāo)準(zhǔn)液質(zhì)量濃度為1，0.5，0.2，0.1，0.05 μg/mL。

1.3.2 Fru-Gly 化合物合成條件單因素試驗(yàn)

1.3.2.1 反應(yīng)時(shí)間 保持葡萄糖和甘氨酸物質(zhì)的量比為3∶1，溶于30 mL 冰乙酸中，在80 ℃水浴條件下回流不同時(shí)間（0.5，1，1.5，2，2.5 h）。反應(yīng)完成后倒入培養(yǎng)皿中，在40 ℃水浴下將冰乙酸揮發(fā)完全，加10 mL 蒸餾水溶解。將樣品置于4 ℃保存，用于后續(xù)的樣品純化。

1.3.2.2 反應(yīng)溫度 保持葡萄糖和甘氨酸物質(zhì)的量比為3∶1，溶于30 mL 冰乙酸中，在不同反應(yīng)溫度（70，75，80，85，90 ℃）下回流1 h，后續(xù)操作同上。

1.3.2.3 葡萄糖和甘氨酸的物質(zhì)的量比 將不同物質(zhì)的量比（5 ∶1，4 ∶1，3 ∶1，2 ∶1，1 ∶1，1 ∶2）葡萄糖和甘氨酸溶于30 mL 冰乙酸中，在80 ℃水浴條件下回流1 h，后續(xù)操作同上。

1.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度及葡萄糖和甘氨酸物質(zhì)的量比3 個(gè)因素，分別以A、B、C 表示并作為自變量進(jìn)行3 水平試驗(yàn)。每個(gè)自變量的低、中、高試驗(yàn)水平分別以-1，0，1 進(jìn)行編碼，以生成Fru-Gly 化合物的濃度為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken 的設(shè)計(jì)原理，利用Design-Expert 8.0.6 軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)曲面分析試驗(yàn)。響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素和水平見表1。

表1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素與水平Table1 The factors and levels of response surface experiment

1.3.4 樣品的純化[19]由于糖、有機(jī)酸等物質(zhì)對(duì)質(zhì)譜分析有基質(zhì)效應(yīng)，因此樣品在LC-TOF MSMS 分析前需進(jìn)行純化。取制備的0.3 mL 樣品加入Amberlite IR-120H+陽離子交換樹脂自制小柱中，先用20 mL 蒸餾水洗脫樹脂，洗去未反應(yīng)的糖等水溶性雜質(zhì)，再用20 mL 0.2 mol/L 氨水溶液洗脫樹脂并收集氨水洗脫液。將此純化洗脫液在50℃條件下真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)5 min，用蒸餾水定容25 mL，即純化樣液，備用，。

1.3.5 Fru-Gly 分析的色譜條件 色譜柱：Shimpack GIST C18（2.1 mm×75 mm，2 μm）；洗脫溶劑：0.1%甲酸乙腈溶液（A）和0.1%甲酸水溶液（B）；流速0.2 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL；等度洗脫：5%A 和95%B。

1.3.6 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源，正離子模式；離子源電壓5 500 V，溫度550 ℃；氣簾氣為206 850 Pa，輔助氣1 為344 750 Pa，輔助氣2 為344 750 Pa；碰撞能18 V；裂解電壓40 V。

1.3.7 Fru-Gly 分析的褐變程度的測定[20]準(zhǔn)確移取1.3.2 節(jié)制備的樣品0.1 mL，稀釋適當(dāng)倍數(shù)后，以蒸餾水作為空白對(duì)照，在波長420 nm 處測定吸光值A(chǔ)420，每個(gè)樣品平行測3 次。

1.3.8 抗氧化活性的測定 測定1.3.4 節(jié)所得純化樣液的抗氧化活性，每個(gè)樣品平行測3 次。

1.3.8.1 DPPH 自由基清除能力的測定 DPPH 自由基清除試驗(yàn)參照Lu 等[21]的方法，并稍作修改。取2 mL 純化樣液，加入2 mL 現(xiàn)配的0.1 mmol/LDPPH 甲醇溶液，混合搖勻后室溫下置于暗處靜置30 min，于波長517 nm 處測定吸光值。DPPH 自由基清除率的計(jì)算公式為：

式中：Ai——純化樣液與DPPH 甲醇溶液的吸光值；Ao——蒸餾水與DPPH 甲醇溶液的吸光值；Aj——純化樣液與甲醇溶液的吸光值。

1.3.8.2 ABTS 自由基清除能力的測定 ABTS 自由基清除試驗(yàn)參考閆旭等[22]的方法并稍作修改。首先配制7 mmol/L ABTS 水溶液和2.45 mmol/L過硫酸鉀水溶液，將兩者的混合物避光放置12～16 h 得到穩(wěn)定的ABTS+·母液。使用時(shí)需將ABTS+·母液用蒸餾水稀釋合適的倍數(shù)，使其在734 nm 處的吸光值為0.70±0.02。

具體操作步驟：取0.8 mL 純化樣液，加入3.2 mL ABTS 工作液，輕微振蕩混勻并置于暗處反應(yīng)6 min，隨后測定734 nm 處的吸光值。ABTS 自由基清除率的計(jì)算公式：

式中：As——純化樣液與ABTS 工作液的吸光值；Ac——蒸餾水與ABTS 工作液的吸光值；Ab——純化樣液與蒸餾水的吸光值。

1.3.8.3 還原能力的測定[23]取2 mL 純化樣液，加入2 mL 0.2 mol/L 磷酸緩沖溶液（pH 6.6）和2 mL 1%鐵氰化鉀（K3Fe（CN）6）溶液，混合均勻后放入50 ℃溫水浴20 min，取出，立即冷卻。加入2 mL 10%三氯乙酸（TCA），振蕩搖勻后取上述溶液2 mL 于新的10 mL 離心管中，加入2 mL 蒸餾水和0.3 mL 0.1%三氯化鐵（FeCl3）溶液，振蕩混勻后靜置10 min，于波長700 nm 處測定吸光值。以2 mL 蒸餾水代替純化樣液，相同操作下測定波長700 nm 處吸光值。吸光值越大，樣品的還原能力越強(qiáng)。還原力的計(jì)算公式：

式中：As——純化樣液的吸光值；Ab——蒸餾水的吸光值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的方差和相關(guān)性分析，用Origin 9.0 作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 Fru-Gly 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

配制一系列不同濃度的Fru-Gly 標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行液-質(zhì)譜分析，定量碎片離子峰為88[19]。以標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程y=131601x+3354.1，相關(guān)系數(shù)R2=0.9998。Fru-Gly 化合物在質(zhì)量濃度0.05～1 μg/mL 范圍與峰面積具有良好的相關(guān)性。

圖1 Fru-Gly 化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Calibrationdata of Fru-Gly compounds

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 反應(yīng)時(shí)間對(duì)反應(yīng)體系生成Fru-Gly 化合物濃度及褐變程度的影響 將純化樣液稀釋100倍，過0.22 μm 濾膜，進(jìn)行液-質(zhì)譜分析。將得到的峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算純化樣液中Fru-Gly化合物濃度，結(jié)果如圖2a 所示。隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，F(xiàn)ru-Gly 化合物的濃度先增加后急劇減少。在Maillard 反應(yīng)的過程中，A420作為監(jiān)測反應(yīng)褐變程度的特征吸收值，是判斷Maillard 反應(yīng)高級(jí)階段的重要標(biāo)志，吸光值越大，Maillard 反應(yīng)的進(jìn)程越快，生成的類黑精也越多，吸光值越小則相反[24]。由圖2b 可知，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，反應(yīng)體系的褐變程度也在增大。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為0.5 h 時(shí)，反應(yīng)體系的吸光值僅為0.334，說明此時(shí)的褐變程度比較小，Maillard 反應(yīng)進(jìn)行到高級(jí)階段的程度低，原因主要在于反應(yīng)時(shí)間過短使反應(yīng)不完全，反應(yīng)結(jié)束后，仍有大量的原料未參與反應(yīng)。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為2.5 h 時(shí)，吸光值達(dá)到1.202，是反應(yīng)時(shí)間為0.5 h 時(shí)的3.6 倍，此時(shí)的褐變程度很高。Fru-Gly 化合物質(zhì)量濃度在反應(yīng)時(shí)間為1 h 時(shí)達(dá)到最大值56.44 μg/mL，之后隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，其濃度迅速降低。由于Amadori 化合物主要在Maillard反應(yīng)的初級(jí)階段形成，反應(yīng)時(shí)間長，生成的Fru-Gly 化合物進(jìn)一步參與Maillard 反應(yīng)的后續(xù)反應(yīng)，導(dǎo)致Fru-Gly 化合物濃度降低，該結(jié)果與圖2b 所示的反應(yīng)時(shí)間大于1 h 后，褐變程度越來越高，反應(yīng)體系進(jìn)行到Maillard 反應(yīng)高級(jí)階段的程度越來越高的結(jié)果保持一致。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為0.5 h 時(shí)，F(xiàn)ru-Gly 化合物的濃度偏低是因?yàn)榉磻?yīng)時(shí)間過短，反應(yīng)不完全，仍有大量反應(yīng)原料未參與反應(yīng)。

圖2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)反應(yīng)體系生成Fru-Gly 化合物濃度及褐變程度的影響Fig.2 Effect of reaction time on the concentration of Fru-Gly compounds generated and browning degree

2.2.2 反應(yīng)溫度對(duì)反應(yīng)體系生成Fru-Gly 化合物濃度及褐變程度的影響 由圖3a 可知，隨著反應(yīng)溫度的增高，F(xiàn)ru-Gly 化合物濃度呈先增加后減少的趨勢。當(dāng)反應(yīng)溫度70～80 ℃時(shí)，隨著溫度的增高，F(xiàn)ru-Gly 化合物濃度不斷增高，80 ℃時(shí)反應(yīng)體系中Fru-Gly 化合物濃度達(dá)到最大值，之后，隨著溫度的增高，F(xiàn)ru-Gly 化合物濃度反而急劇減少。由圖3b 可以看出，隨著反應(yīng)溫度的增高，反應(yīng)體系的褐變程度不斷增加。Maillard 反應(yīng)受溫度的影響較大，溫度越高，褐變程度越大，褐變的速率也越大[25]。當(dāng)溫度從70 ℃升到80 ℃時(shí)，褐變的速率遠(yuǎn)小于溫度從80 ℃升到90 ℃的。當(dāng)反應(yīng)溫度為70 ℃時(shí)，反應(yīng)不完全，有大量的原料剩余。當(dāng)反應(yīng)溫度為75 ℃時(shí)，仍有少量的原料剩余，這也是這兩個(gè)溫度下，反應(yīng)體系褐變程度較低的原因。結(jié)合圖3a、3b 可知，溫度越高，反應(yīng)體系的褐變程度越高，Maillard 反應(yīng)的進(jìn)程越大，生成的部分Fru-Gly化合物參與Maillard 反應(yīng)的后續(xù)反應(yīng)。當(dāng)溫度超過80 ℃時(shí)，反應(yīng)體系生成的Fru-Gly 化合物濃度逐漸降低。當(dāng)溫度低于80 ℃時(shí)，反應(yīng)體系仍有相當(dāng)部分原料未參與反應(yīng)，導(dǎo)致Fru-Gly 化合物的濃度低。

圖3 反應(yīng)溫度對(duì)反應(yīng)體系生成Fru-Gly 化合物濃度及褐變程度的影響Fig.3 Effect of reaction temperature on the concentration of Fru-Gly compounds generated and browning degree

2.2.3 物質(zhì)的量比對(duì)反應(yīng)體系生成Fru-Gly 化合物濃度及褐變程度的影響 由圖4a 可知，隨著反應(yīng)體系中葡萄糖和甘氨酸物質(zhì)的量比的逐漸減小，反應(yīng)體系生成Fru-Gly 化合物的濃度先小幅度減少，然后小幅度增加，最后急劇減少。當(dāng)葡萄糖和甘氨酸物質(zhì)的量比為3∶1 時(shí)，反應(yīng)體系生成Fru-Gly 化合物的質(zhì)量濃度達(dá)到最大值56.82 μg/mL。當(dāng)物質(zhì)的量比為2∶1 時(shí)，F(xiàn)ru-Gly 化合物的含量急劇減小到27.49 μg/mL。結(jié)合圖4b 可知，物質(zhì)的量比為2∶1 的反應(yīng)體系褐變程度最大，Maillard反應(yīng)也最為徹底，說明Fru-Gly 化合物進(jìn)一步參與Maillard 反應(yīng)的后續(xù)反應(yīng)，導(dǎo)致測得的Fru-Gly化合物濃度很低，兩者的結(jié)果一致。當(dāng)物質(zhì)的量比大于2∶1 時(shí)，反應(yīng)體系生成的Fru-Gly 化合物的濃度均較高且相差較小。當(dāng)物質(zhì)的量比小于2∶1時(shí)，其濃度急劇減小，說明合成Amadori 化合物的反應(yīng)體系中過量的葡萄糖可能有利于Amadori 化合物生成。

由圖4b 可知，葡萄糖和甘氨酸的物質(zhì)的量比為2∶1 時(shí)，反應(yīng)體系的褐變程度最大。當(dāng)物質(zhì)的量比大于2∶1 時(shí)，褐變程度無明顯差別，Maillard 反應(yīng)程度基本保持一致；當(dāng)物質(zhì)的量比為1∶1 時(shí)，反應(yīng)體系的褐變程度開始急劇減小；當(dāng)物質(zhì)的量比為1∶2 時(shí)的褐變程度又小幅度增加。這說明當(dāng)葡萄糖和甘氨酸的物質(zhì)的量為2∶1 時(shí)，Maillard 反應(yīng)最為徹底，反應(yīng)程度最大。反應(yīng)體系中葡萄糖的量過少時(shí)，嚴(yán)重影響Maillard 反應(yīng)的進(jìn)行。

圖4 物質(zhì)的量比對(duì)反應(yīng)體系生成Fru-Gly 化合物濃度及褐變程度的影響Fig.4 Effect of molar ratio on the concentration of Fru-Gly compounds generated and browning degree

2.3 響應(yīng)曲面試驗(yàn)結(jié)果及方差分析

2.3.1 Box-Behnken 設(shè)計(jì)試驗(yàn) 以反應(yīng)時(shí)間（A）、反應(yīng)溫度（B）和物質(zhì)的量比（C）3 個(gè)因素為自變量，測得的Fru-Gly 化合物濃度為響應(yīng)指標(biāo)，根據(jù)Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)原理進(jìn)行響應(yīng)曲面試驗(yàn)，結(jié)果見表2。

2.3.2 模型建立與方差分析 利用Design-Expert 8.0.6 軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)擬合回歸分析，得到響應(yīng)值與因素編碼值之間的二次多項(xiàng)回歸方程為：

Y=60.69-3.75A-1.43B+3.50C+3.86AB-8.15AC+0.90BC-16.24A2-4.55B2-10.02C2

對(duì)響應(yīng)曲面試驗(yàn)結(jié)果（表2）進(jìn)行方差（ANOVA）分析，結(jié)果見表3。由表3可知，模型的Prob＞F=0.0267（P＜0.05），表明該模型具有顯著性，模型的建立有意義。此外，該模型的F 值為4.71，表明模型僅有4.71%的可能性是由干擾造成的。模型的失擬項(xiàng)值為0.0652，不顯著，說明模型較合適，試驗(yàn)的相對(duì)誤差較小，可用此模型對(duì)Fru-Gly 化合物的濃度進(jìn)行分析和預(yù)測。反應(yīng)時(shí)間的二次項(xiàng)（A2）對(duì)Fru-Gly 化合物的濃度影響極顯著（P＜0.01），而葡萄糖與甘氨酸的物質(zhì)的量比（C2）對(duì)Fru-Gly 化合物的濃度影響顯著（P＜0.05）。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table2 Design and results of response surface experiment

表3 響應(yīng)曲面試驗(yàn)結(jié)果與方差分析結(jié)果Table3 Response surface test results and variance analysis results

2.3.3 響應(yīng)面圖及等高線圖分析 響應(yīng)面圖可直觀反映各參數(shù)與最佳參數(shù)之間的相互作用，等高線的形狀反映不同因素間相互影響的強(qiáng)弱。等高線呈橢圓形表示兩個(gè)因素間的相互作用明顯，等高線呈圓形則相反。

圖5 各因素交互作用的響應(yīng)面及等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots of various factors

由圖5a 可知，響應(yīng)曲面的坡度較陡峭，說明Fru-Gly 化合物濃度對(duì)反應(yīng)時(shí)間和溫度較為敏感。在反應(yīng)溫度不變的條件下，反應(yīng)體系生成Fru-Gly化合物的濃度隨著反應(yīng)時(shí)間的增加呈先升高后降低的趨勢，且變化較大。在反應(yīng)時(shí)間不變的條件下，隨著反應(yīng)溫度的升高，F(xiàn)ru-Gly 化合物濃度呈先上升后下降的趨勢，變化較小。從等高線可以看出，反應(yīng)時(shí)間與溫度交互作用顯著。

由圖5b 可知，響應(yīng)曲面的坡度比較陡峭，說明Fru-Gly 化合物的濃度對(duì)反應(yīng)時(shí)間和物質(zhì)的量比較為敏感。在物質(zhì)的量比不變的條件下，反應(yīng)體系生成Fru-Gly 化合物的濃度隨著反應(yīng)時(shí)間的增加呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢。在反應(yīng)時(shí)間不變的條件下，隨著物質(zhì)的量比的升高Fru-Gly 化合物濃度呈先迅速上升后緩慢下降的趨勢。從等高線可以看出，反應(yīng)時(shí)間與物質(zhì)的量比交互作用顯著。

由圖5c 可知，響應(yīng)曲面的坡度比較陡峭，說明Fru-Gly 化合物濃度對(duì)反應(yīng)溫度和物質(zhì)的量比較為敏感。在反應(yīng)溫度不變的條件下，反應(yīng)體系生成Fru-Gly 化合物的濃度隨著物質(zhì)的量比的增大呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，且變化較大。在物質(zhì)的量比不變的條件下，隨著反應(yīng)溫度的升高，F(xiàn)ru-Gly 化合物的濃度呈先上升后下降的趨勢，變化較小。從等高線可以看出，反應(yīng)溫度與物質(zhì)的量比交互作用顯著。

通過響應(yīng)曲面試驗(yàn)分析，生成Fru-Gly 化合物濃度的最佳反應(yīng)條件為反應(yīng)時(shí)間0.9 h，反應(yīng)溫度79 ℃，葡萄糖和甘氨酸物質(zhì)的量比3.25∶1。依此條件做驗(yàn)證試驗(yàn)，F(xiàn)ru-Gly 化合物質(zhì)量濃度為58.80 μg/mL，與模型預(yù)測值的誤差小于5%。由此可見，該模型具有實(shí)用價(jià)值。

2.4 反應(yīng)體系生成Fru-Gly 化合物的濃度與其抗氧化能力的相關(guān)性分析

由圖6可知，反應(yīng)體系純化樣液Fru-Gly 化合物的濃度與其DPPH 自由基清除能力、ABTS 自由基清除能力及還原能力具有相同的變化趨勢，即隨著反應(yīng)體系Fru-Gly 化合物濃度的增大，3 種抗氧化能力均增強(qiáng)，且DPPH 自由基清除能力始終大于ABTS 自由基清除能力。

圖6 反應(yīng)體系Fru-Gly 化合物的濃度與其抗氧化能力的關(guān)系Fig.6 The relationship between the concentration of Fru-Gly and its antioxidant capacity in the reaction system

表4列出采用Pearson’s 相關(guān)系數(shù)分析反應(yīng)體系生成Fru-Gly 化合物的濃度與其抗氧化能力的相關(guān)性，結(jié)果表明，F(xiàn)ru-Gly 化合物的濃度與DPPH 自由基清除能力、ABTS 自由基清除能力以及還原能力互為極顯著正相關(guān)，且相關(guān)性系數(shù)均大于0.96。由相關(guān)性分析結(jié)果可推測，反應(yīng)體系Fru-Gly 化合物的濃度越高，其3 種抗氧化能力越強(qiáng)。

表4 反應(yīng)體系Fru-Gly 化合物濃度與其抗氧化能力相關(guān)性分析Table4 Correlation analysis between the concentration of Fru-Gly and its antioxidant capacity in the reaction system

3 結(jié)論

優(yōu)化合成Fru-Gly 化合物的條件，研究其抗氧化活性，以DPPH 自由基清除率、ABTS 自由基清除率及還原力評(píng)價(jià)樣品的抗氧化性能。結(jié)果表明，F(xiàn)ru-Gly 化合物具有一定的抗氧化能力，反應(yīng)體系Fru-Gly 化合物的濃度越高，其3 種抗氧化能力越強(qiáng)，且DPPH 自由基清除率始終大于ABTS自由基清除率。生成Fru-Gly 化合物濃度的最佳反應(yīng)條件為反應(yīng)時(shí)間0.9 h，反應(yīng)溫度79 ℃，葡萄糖和甘氨酸物質(zhì)的量比3.25∶1。

相關(guān)性分析結(jié)果表明，F(xiàn)ru-Gly 化合物濃度與DPPH、ABTS、還原力法測定的抗氧化能力呈極顯著相關(guān)性（P＜0.01）。合成Amadori 化合物時(shí)，可通過分光光度法對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行DPPH 自由基清除率、ABTS 自由基清除率及還原力測定，根據(jù)抗氧化性高低監(jiān)測Amadori 化合物生成程度，從而避免Amadori 化合物標(biāo)準(zhǔn)品難以獲取的不足及用UPLC-TOF MS-MS 設(shè)備檢測定量Amadori 化合物的高昂費(fèi)用，既簡便易行，又節(jié)省成本。