正丁醇同步萃取油茶餅多組分研究

謝益仙 肖志紅 吳 紅,,3 黎繼烈 張愛華, 李培旺 田 宏

(中南林業(yè)科技大學1，長沙 410004)湖南省林業(yè)科學院油脂分子構效湖南省重點實驗室2，長沙 410004)(湖南省林業(yè)科學院南方木本油料利用科學國家林草局重點實驗室3，長沙 410004)(湖南糧食集團有限公司4，長沙 410005)(南開大學5，天津 300071)

油茶(CamelliaoleiferaAbel)被譽為世界四大木本油料之一[1]，屬茶科，常綠小喬木。油茶籽是我國重要的食用油原料，壓榨茶油后得到油茶餅，茶油餅中仍富含茶油、茶皂素、磷脂、蛋白質、角鯊烯等多種天然活性成分[2-4]。茶皂素是一種糖式化合物，是一種天然非離子型表面活性劑[5]，具有鎮(zhèn)痛、抗?jié)B透等藥理作用[6，7]，水提法和乙醇提取法的茶皂素碳水化合物含量高，進一步純化利用較為困難[8]。磷脂是天然表面活性劑，具有生理調節(jié)機能，在人體的新陳代謝、免疫力的提高、疾病的預防等方面都有一定的作用[ 9，10 ]，廣泛用于食品、醫(yī)藥、飼料、化妝品、紡織品、石油化工等行業(yè)[11]。油茶餅的開發(fā)利用有利于資源的再利用，可以產生一定的經濟效益。

油茶餅多組分提取方法有水提法、有機溶劑萃取法、超臨界CO2萃取法、亞臨界萃取法等。水提法設備條件要求不高、成本低、但目標產物提取率較低且需分步提取多組分，朱俊朋等[12]采用水提-醇萃法提取油茶餅中茶皂素時，在最佳提取條件下茶皂素提取率達到8.33%，提取率較低；有機溶劑萃取法成本低、效率高但產品的后續(xù)處理較為復雜且產品質量不高，宗毅等[13]采用超聲波-甲醇法提取茶皂素，在最佳實驗條件下的茶皂素純度達到59.30%；超臨界CO2萃取和亞臨界萃取操作簡單、目標產物提取率高但成本較高、設備投資較大且較難實現規(guī)?；a?？傊?，目前針對油茶餅中殘油、茶皂素、磷脂等多組分的提取技術存在耗時耗能、安全性低、產品質量不高的缺陷。根據本課題組前期研究得出醇基溶劑對油茶餅同步萃取效果優(yōu)于常規(guī)有機溶劑，如以正丁醇水溶液為溶劑對茶皂素和茶油的同步提取，茶油提取率達到92.88%，茶皂素提取率達到43.20%[14]，實現了茶油、皂素和磷脂等多組分的同步萃取，而且后期通過簡單的旋轉蒸發(fā)就可以逐步實現油脂、皂素和磷脂的分離。與傳統(tǒng)方法對比，正丁醇水提取顯示出一定的優(yōu)勢。因此，本實驗在課題組前期研究的基礎上，著力于正丁醇對油茶餅中多組分同步萃取的研究工作，重點探究正丁醇同步萃取油茶過程中更多組分溶出規(guī)律及其相互作用對茶皂素純度的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

茶籽餅：湖南省林業(yè)科學院；茶皂素標準品；正丁醇、無水乙醇、石油醚、香草醛、濃硫酸、硫酸肼等試劑均為分析純。

UV-2800雙光束/紫外可見分光光度計；SZF-06A粗脂肪測定儀。

2 實驗方法

2.1 油茶餅原料的組分分析方法

2.1.1 油茶餅原料水分及揮發(fā)物的測定

油茶餅原料中水分及揮發(fā)物的測定方法同GB/T 10358—2008《油料餅粕水分及揮發(fā)物含量的測定》。

2.1.2 茶油的測定

油茶餅及濾渣中含油率的測定方法同GB/T 14488.1—2008《植物油料含油量測定》。

(1)

式中：M1為參與同步萃取的茶籽餅原料質量/g；P1為茶籽餅原料中的含油率/%；m1為茶籽餅濾渣的質量/g；P2為測得的茶籽餅濾渣的殘油率/%。

2.1.3 茶皂素含量的測定

茶皂素標準曲線及含量的測定按文獻[15]方法操作?？傻脴藴是€回歸方程為：

y=1.082 6x+0.002 7，R2=0.999 5。

(2)

(3)

式中：c為茶皂素質量濃度/mg/mL；V為茶皂素溶液的體積/mL；n為茶皂素溶液稀釋倍數；m為原料中茶皂素質量/mg；M為茶皂素提取物質量/mg。

2.1.4 磷脂含量的測定

磷脂標準曲線及含量的測定方法同GB/T 5537—2008《糧油檢驗磷脂含量的測定》。

可得標準曲線回歸方程為：y=10.88x-0.033 2，R2=0.999。

(4)

式中：c為磷脂質量濃度/mg/mL；V為溶液的體積/mL；m為原料中磷脂質量/mg。

2.1.5 蛋白質含量的測定

油茶餅原料及濾渣中蛋白質的測定方法參考GB/T 31578—2015《糧油檢驗糧食及制品中粗蛋白測定杜馬斯燃燒法》。

2.1.6 碳水化合物含量的測定

油茶餅原料及溶出物質中碳水化合物的測定按文獻[16]方法操作。

2.1.7 油茶餅多組分同步萃取工藝

稱取500 g粉碎后的油茶餅粕(干基)，與一定體積的正丁醇在不同的pH(3.5～5.5)，溫度(50～90 ℃)，液料比(4∶1～12∶1) mL/g和正丁醇含水量(0%～20%)條件下回流萃取。提取完全后快速以確保體系在同等溫度下離心分離。之后用少量同溫度正丁醇與固體相混合后離心分離2次，合并正丁醇相。小心的收集固體相，用于油脂、皂素、磷脂、蛋白質和碳水化合物的提取率測定。旋轉蒸發(fā)儀蒸發(fā)，隨著含水量的減少，首先蒸發(fā)出來的是磷脂，其次是皂素，最后蒸發(fā)出來的是油脂，從而實現三組主要物質的分離。

2.1.8 響應面法優(yōu)化油茶餅多組分同步萃取工藝

采用Box-Behnken中心組合實驗設計方案，根據單因素實驗固定正丁醇含水量20%、萃取時間120 min，選取對油茶餅中茶皂素溶出率及茶皂素純度影響較大的萃取pH、萃取溫度、萃取液料比3個因素進行響應面分析，建立茶皂素溶出率及純度的回歸方程，優(yōu)化茶皂素純度及萃取工藝參數。

3 結果與討論

3.1 茶籽餅中主要成分

表1所示為本實驗所用油茶餅中主要成分組成含量。由表1可知，油茶餅具有低蛋白質、磷脂含量，高茶皂素含量的特點，與文獻[17]相比，茶皂素、磷脂含量略高，這是因為原料產地、品種等都不相同。文獻中報道，雙親性的物質如茶皂素、磷脂和蛋白質等，對油脂的溶出有不同程度的促進作用，而每種物質的促進作用又各不相同。本實驗將重點研究各組分溶出的規(guī)律及其相互作用關系，尤其研究各組分相互作用對茶皂素純度的影響規(guī)律。

表1 油茶餅中主要成分組成

3.2 不同條件對油茶餅多組分溶出率及茶皂素純度的影響

3.2.1 pH對油茶餅多組分溶出率及茶皂素純度的影響

提取體系的pH對皂素的溶出及純度具有非常顯著的影響作用[18]。茶皂素含有雙親基團具有表面活性，其表面活性容易受到體系pH的影響，在文獻報道中[19]發(fā)現茶皂素在弱酸性環(huán)境中表面活性較高。因此，考察體系pH的影響具有重要意義。

固定萃取溫度80 ℃、萃取液料比8∶1 mL/g、正丁醇含水量20%、萃取時間120 min，在pH 3.5～5.5范圍內，隨著pH的升高，茶油、茶皂素、磷脂的溶出率及茶皂素純度呈現出先增加后減少的趨勢，蛋白質的溶出率呈現先減少后增加，碳水化合物溶出率有輕度增加。當pH增加到4.5時，茶油溶出率63.56%升高到74.01%，茶皂素溶出率從87.05%升高到90.60%，磷脂溶出率從29.96%增加到38.02%，茶皂素純度從71.35%增加到77.50%，蛋白質溶出率從30.54%降低到27.93%。在提取體系pH變化過程中茶油、茶皂素、磷脂溶出率及茶皂素純度變化趨勢相同，與蛋白質溶出率變化趨勢相反，萃取pH對茶皂素純度影響較大，與胡福田等[20]采用微波預處理超聲波協(xié)助水浸提茶皂素試驗相比茶皂素純度提高22.82%，蛋白質溶出率較低，其等電點在4.5左右[21]，體系中茶皂素與茶油分子溶出能力較強，茶皂素能降低水的表面能且對茶油具有一定的增溶作用[22]。綜合考慮選取pH 4.5為最佳萃取溫度。

3.2.2 溫度對油茶餅多組分溶出率及茶皂素純度的影響

提取體系的溫度對茶皂素的提取率及純度都有較大的影響[23]，溫度過低，不利于各組分溶出，溫度過高會使更多的雜質溶出降低茶皂素的純度。

固定萃取pH 4.5、萃取液料比8∶1 mL/g、正丁醇含水量20%、萃取時間120 min，在溫度50～80 ℃時，茶油、茶皂素溶出率及茶皂素純度均呈上升趨勢，低溫影響茶油及皂素在正丁醇水溶液中的溶解度[24]。在80～90 ℃茶油和茶皂素溶出率及茶皂素純度都有少許降低；隨著溫度增加磷脂溶出率從30.48%增加到38.91%，而蛋白質和碳水化合物溶出率呈現減少趨勢，蛋白質溶出率從32.42%減少到25.47%，碳水化合物溶出率從14.70%減少到10.30%。在提取溫度變化過程中，茶油、茶皂素溶出及茶皂素純度變化趨勢相同與磷脂溶出變化相似，溫度升高對茶油溶出的促進作用較為明顯，主要是因為溫度升高使油茶餅組織變得疏松，細胞結構被出率呈現減少趨勢，蛋白質溶出率從32.42%減少到25.47%，碳水化合物溶出率從14.70%減少到10.30%。在提取溫度變化過程中，茶油、茶皂素溶出及茶皂素純度變化趨勢相同與磷脂溶出變化相似，溫度升高對茶油溶出的促進作用較為明顯，主要是因為溫度升高使油茶餅組織變得疏松，細胞結構被破壞；蛋白質與碳水化合物溶出趨勢相同，蛋白質和碳水化合物的溶出逐漸減少，溫度較高時，蛋白質和碳水化合物結構遭到破壞，其活性成分受到影響，蛋白質和碳水化合物溶出減少，有利于茶皂素純度的增加。綜合考慮選取80 ℃為最佳萃取溫度。

圖1 pH對各組分溶出率及茶皂素純度的影響

圖2 萃取溫度對各組分溶出率及茶皂素純度的影響

圖3 萃取液料比對各組分溶出率及茶皂素純度的影響

3.2.3 液料比對油茶餅多組分溶出率及茶皂素純度的影響

提取液料比對各成分溶出及茶皂素純度影響不相同，最佳液料比可避免造成資源浪費。

固定萃取pH 4.5、萃取溫度80 ℃、正丁醇含水量20%、萃取時間120 min，在液料比4∶1 ～12∶1 mL/g范圍內，茶油、茶皂素、磷脂、蛋白質和碳水化合物溶出率一直在增加，茶油溶出率從63.48%增加到76.15%，茶皂素溶出率從55.69%增加到92.20%，磷脂溶出率從30.22%增加到39.07%，蛋白質溶出率13.99%增加到29.07%，碳水化合物溶出率從4.35%增加到12.04%，隨液料比增加油茶餅中有效成分溶出率趨勢相同，茶皂素純度呈現出先增加后減小的趨勢，液料比增加有利于溶劑與物料的充分接觸，但液料比較大時，雜質溶出也會越多。在液料比10∶1 mL/g時，茶皂素純度達到最大值78.26%。在該體系中茶皂素分子溶出競爭力較大，溶出率增加較為明顯。綜合考慮選取10∶1 mL/g為最佳萃取料比。

3.2.4 正丁醇含水量對油茶餅多組分溶出及茶皂素純度的影響

正丁醇、茶皂素、茶油和水互溶后可形成一個極性可調的溶劑體2系，該體系具有“雙親增溶”特性，適用于油茶多組分的同步提取。因此考察含水量對溶出率及茶皂素純度的影響。

固定萃取pH 4.5、萃取溫度80 ℃、萃取液料比10∶1 mL/g、萃取時間120 min，在正丁醇含水量0～20%(質量分數)范圍內，茶皂素溶出率從19.29%增加到91.54%；茶皂素純度從48.38%提高到78.12%；隨著正丁醇含水量的增加，茶油和磷脂溶出率先輕度降低再增加；蛋白質溶出率增加；碳水化合物溶出率隨含水量增加而增加。隨著茶皂素的溶出，能夠有效的改變正丁醇-水體系的極性大小，形成一個“雙親增溶”體系對茶油具有一定的增溶作用，從而實現茶油、茶皂素的同步高效溶出[25]。正丁醇含水量20%時，茶皂素溶出率為91.54%，純度為78.12%，與易笑生等[26]進行的正丁醇(含水量5%)萃取茶皂素和茶油相比，茶皂素溶出率提高48%，茶皂素在水中的溶解性稍大于在正丁醇中的溶解性，由于水在正丁醇中的最大溶解度為20.1%(質量分數)，綜合考慮選取正丁醇含水量20%為最佳萃取含水量。

圖4 正丁醇含水量對各組分溶出率及茶皂素純度的影響

3.2.5 萃取時間對油茶餅多組分溶出及茶皂素純度的影響

傳統(tǒng)提取方法中大多數存在提取時間長的缺陷，就會造成效率低，設備利用率低等問題，縮短時間能有效的節(jié)約成本，創(chuàng)造更大的經濟價值。

固定萃取pH 4.5、萃取溫度80 ℃、萃取液料比10∶1 mL/g、正丁醇含水量20%，在萃取時間30～120 min范圍內，隨時間的增加茶皂素、茶油、磷脂、蛋白質和碳水化合物的溶出率呈現出增加的趨勢。在萃取初期，萃取時間越長，各有效成分的溶出率也就越高。隨著時間的延長，各有效成分溶出率有略微下降，這可能是因為有效成分在溶劑中溶解度達到飽和，萃取時間較長，茶皂素可能發(fā)生水解；在該體系中萃取時間120 min時，茶皂素溶出率達到90.1%，馬力等[27]在以水為溶劑萃取油茶餅中茶皂素時達到相似溶出率需要萃取時間8 h；茶皂素純度隨萃取時間的延長而降低，萃取時間越長雜質溶出越多對茶皂素純度影響越大。綜合考慮選取萃取時間120 min為最佳萃取時間。

圖5 萃取時間對各組分溶出率及茶皂素純度的影響

3.3 同步萃取油茶餅多組分最佳工藝響應面試驗結果與分析

3.3.1 響應面實驗結果

根據單因素實驗結果，萃取pH、萃取溫度、萃取液料比對茶皂素溶出率及茶皂素純度影響較大，因此響應面試驗以茶皂素溶出率及茶皂素純度為響應值采用3因素3水平的響應面分析方法，以萃取pH、萃取溫度、萃取液料比為自變量對工藝參數進行優(yōu)化。設計因素與水平編碼表如表2及表3所示。

3.3.2 響應面優(yōu)化分析

運用Design Expert 8.0.6軟件對實驗數據進行分析處理，得到方差結果，如表4所示。

Y1(茶皂素溶出率)=91.89-1.04A+0.80B+1.79C+0.29AB+0.19BC-2.61A2-0.31B2-1.88C2

Y2(茶皂素純度)=78.72+0.51A+0.33B+0.31C+0.28AC-2.591A2-0.73B2-0.99C2

由表4、表5可知，A、B、C、A2、B2、C2對響應值茶皂素的溶出率及茶皂素的純度影響極顯著(P<0.000 1)。失擬差P>0.05，表明模型的失擬度不顯著，回歸系數R2分別為0.999 2、0.996 4，表明預測值與試驗值具有良好的擬合性，校正后的復測相關系數Radj2分別為0.998 2、0.991 7，測試值與校正值均較大且較為接近，表明該模型擬程度良好。

表2 Box-Benhnken實驗因素及其水平表

表3 Box-Benhnken實驗結果表

表4 茶皂素溶出率的回歸方差分析

注：**表示，差異極顯著(P<0.01)；*表示，差異顯著(P<0.05)。

表5 茶皂素純度的回歸方差分析

注：**表示，差異極顯著(P<0.01)；*表示，差異顯著(P<0.05)。

3.3.3 交互作用分析

根據模型方差分析可以得出萃取pH、萃取液料比和萃取溫度對茶皂素溶出率影響極顯著，兩因素的交互作用對茶皂素溶出率的影響較大的是萃取pH和萃取溫度、萃取溫度和液料比。隨著萃取pH的增加，茶皂素溶出率先增加達到最高值后下降，茶皂素溶出率的下降可能是當pH較大時引起茶皂素的水解[28]；萃取pH與萃取液料比之間交互作用不顯著，這可能是因為實驗中考察這兩個變量的范圍較小，沒有更好的顯示出變量范圍更大后的交互作用變化規(guī)律；萃取溫度對茶皂素溶出率影響較小。

對茶油餅中茶皂素純度響應值的影響及其交互作用中萃取pH對茶皂素純度的影響程度最大，萃取溫度次之，萃取液料比影響最小，兩因素的交互作用對茶皂素純度的影響較明顯的是萃取pH和萃取液料比。隨萃取pH的增加，茶皂素純度呈現先增加后減小的趨勢，茶皂素純度降低的原因可能是萃取pH增加會導致更多雜質溶出。

根據二次回歸方程的數學模型分析，得到的最佳萃取工藝條件：萃取pH為4.52、萃取溫度83.80 ℃、萃取液料比10.60 mL/g、在此條件下茶皂素溶出率及茶皂素純度理論值分別為92.50%、78.76%。在驗證響應面法的可行性的基礎上，為了便于實際的操作，將最佳工藝條件修正為萃取pH為4.50、萃取溫度84 ℃、萃取液料比10.60 mL/g。

3.3.4 回歸模型的驗證

按照優(yōu)化后的工藝條件進行3次平行實驗以驗證BBD設計所得結果的可靠性，試驗所得茶皂素溶出率為(92.38±0.57)%，茶皂素純度為(78.47±0.37)%，與理論預測值相比無明顯差異，基本符合理論，表明所建的模型有效。

3.3.5 本方法與醇提和水提對比

本方法與醇提法、水提法萃取效果對比見表6，本方法具有提取率高、產品純度較高的優(yōu)勢。

表6 不同復合溶劑萃取效果比較

4 結論

正丁醇/水復合溶劑處理油茶餅粕，研究各組分溶出的規(guī)律及其相互作用關系，重點研究各組分的相互作用對茶皂素純度的影響規(guī)律。通過單因素實驗分析確定油茶餅多組分同步萃取的工藝條件為萃取pH 4.5、萃取溫度80 ℃、萃取液料比10∶1 mL/g、正丁醇含水量20%、萃取時間120 min。在單因素實驗結果基礎上，通過響應面試驗設計考察萃取pH、萃取溫度、萃取液料比3個因素及其相互作用對茶皂素溶出率及純度的影響，得出最佳提取工藝：萃取pH為4.50、萃取溫度84 ℃、萃取液料比10.60 mL/g，在該條件下，茶皂素溶出率為(92.38±0.57)%，茶皂素純度為(78.47±0.37)%。與傳統(tǒng)提取方法相比，正丁醇/水復合溶劑萃取茶皂素的提取率顯著提高，碳水化合物等難分離物質顯著減少，有利于茶皂素的進一步純化利用。