多殺性巴氏桿菌NarQ-NarP信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)的作用初探

【摘 要】目的 本研究旨在探究血清A型多殺性巴氏桿菌中NarQ-NarP雙組份信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)是否具有調(diào)控硝酸鹽代謝的作用。方法 用硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)檢測(cè)多殺性巴氏桿菌是否具有還原硝酸鹽的能力;然后將血清A型多殺性巴氏桿菌在含有不同濃度硝酸鹽的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，提取培養(yǎng)液總RNA，用實(shí)時(shí)熒光定量法測(cè)定narQ、narP在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)量，并用相對(duì)定量分析法比較了多殺性巴氏桿菌NarQ-NarP雙組分系統(tǒng)在不同硝酸鹽濃度下基因轉(zhuǎn)錄水平的變化。結(jié)果 不同濃度硝酸鹽對(duì)narQ、narP的表達(dá)量均產(chǎn)生了不同程度的影響。結(jié)論 血清A型多殺性巴氏桿菌的NarQ-NarP雙組分系統(tǒng)與硝酸鹽的代謝密切相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】多殺性巴氏桿菌;NarQ-NarP;硝酸鹽

巴氏桿菌是一種廣泛分布于世界各地的細(xì)菌，由巴斯德氏在1880年首先自病雞分離得到。巴氏桿菌病是一種由巴氏桿菌屬細(xì)菌引起的一種急性、熱性、畜禽共患的傳染病，危害極大。而引起該病的主要病原體細(xì)菌就是其中的多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida），也是本屬中對(duì)畜禽的危害中表現(xiàn)最為嚴(yán)重的一種，同時(shí)該菌也能感染人類(lèi)，因此一直受到社會(huì)的廣泛關(guān)注[1]。

細(xì)菌的生存離不開(kāi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，雙組份系統(tǒng)是廣泛存在于細(xì)菌中的一種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)體系，在大腸桿菌中第一次被發(fā)現(xiàn)，后續(xù)大量的研究表明該系統(tǒng)對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)、分化、代謝、繁殖等都有不同程度的調(diào)控作用[2]。但是在目前已有的研究中，有關(guān)巴氏桿菌的雙組份信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究很少。前期基因組測(cè)序及數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)顯示，巴氏桿菌中存在著多組雙組份系統(tǒng)，且存在著與大腸桿菌結(jié)構(gòu)類(lèi)似的能夠調(diào)控硝酸鹽代謝的NarQ-NarP二元雙組份信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)。本研究先用硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)明確了牛源A型多殺巴氏桿菌具有還原硝酸鹽的能力，然后在巴氏桿菌培養(yǎng)基中添加不同濃度硝酸鹽，在此基礎(chǔ)上檢測(cè)該多殺性巴氏桿菌的NarQ-NarP雙組份信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的兩個(gè)構(gòu)成元件narQ、narP在轉(zhuǎn)錄水平上的變化，研究結(jié)果表明該信號(hào)系統(tǒng)與環(huán)境中硝酸鹽濃度變化具有密切關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

重慶某奶牛場(chǎng)分離得到的牛源A型多殺性巴氏桿菌血清強(qiáng)毒株。

1.2 主要試劑

①生物工程有限公司生產(chǎn)的narQ、narP引物

②Invitrogen公司生產(chǎn)的16s引物

③硝酸鹽還原生化管

④馬丁氏肉湯

⑤康為世紀(jì)公司的Ultrapure RNA Kit（超純RNA提取試劑盒）、HiFiScript Quick gDNA Removal cDNA Kit（HiFiScript快速去基因組cDNA第一鏈合成試劑盒）

⑥BIO-RAD公司的SsoFast EvaGreen Supermix及Optical Flate 8-Cap Strips for 0.2ml tube strips

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)

將培養(yǎng)的牛源A多殺性巴氏桿菌接種于硝酸鹽還原生化管中，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)或以上，同時(shí)以一支接種等量滅菌生理鹽水的培養(yǎng)基做空白對(duì)照。

1.3.2 不同濃度硝酸鹽和亞硝酸鹽培養(yǎng)基的配制

在配制好的馬丁肉湯中分別添加終濃度為0g、0.25g、0.5g、0.75g、1.0g、1.25g、1.5g的硝酸鹽，每個(gè)培養(yǎng)基中后續(xù)提取的總RNA樣品分別標(biāo)記為0、1、2、3、4、5、6號(hào)樣品。

1.3.3 RNA的提取

按Ultrapure RNA Kit操作步驟提取細(xì)菌培養(yǎng)液中總RNA，并用核酸檢測(cè)儀測(cè)定每個(gè)樣品所提取的總RNA濃度和純度。

1.3.4 反轉(zhuǎn)錄

按康為世紀(jì)公司的HiFiScript Quick gDNA Removal cDNA Kit操作步驟去除基因組DNA（反應(yīng)體系見(jiàn)表F1，反應(yīng)條件42℃孵育2min），并對(duì)RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄（反應(yīng)體系見(jiàn)表F2，反應(yīng)條件42℃孵育15min，85℃孵育5min，然后-20℃保存）。

1.3.5 熒光定量PCR

①選擇多殺性巴氏桿菌16s為內(nèi)參糾正上樣量的誤差。

②RT-PCR 反應(yīng)體系如下表F3：

③樣品：為了保證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，每個(gè)不同硝酸鹽濃度下樣品的每一個(gè)基因（narQ、narP、16s）設(shè)置了3個(gè)重復(fù)數(shù)。

④熒光定量PCR，約1.5h。

1.3.6 相對(duì)定量法

該法用來(lái)分析熒光定量PCR數(shù)據(jù)，即通過(guò)Cq值來(lái)確定目的基因的表達(dá)差異倍數(shù)，Cq值是指擴(kuò)增過(guò)程中熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。該方法假定目的基因和內(nèi)參的表達(dá)為1，當(dāng)相對(duì)表達(dá)倍數(shù)大于1時(shí)，表示處理后的樣品該基因表達(dá)量增加，反之，則表達(dá)量減少。

2 結(jié)果

2.1 硝酸鹽還原試驗(yàn)

硝酸鹽還原試驗(yàn)中，試驗(yàn)生化管中的液體變?yōu)榧t色，呈陽(yáng)性反應(yīng);空白對(duì)照管的結(jié)果呈陰性，液體顏色無(wú)任何變化。結(jié)果如下圖J1。

2.2 RNA的提取

各提取樣品RNA濃度測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表J1。

2.3 熒光定量PCR

各樣品的熒光定量PCR的平均Cq值見(jiàn)表J2。

根據(jù)熒光定量PCR相對(duì)定量法計(jì)算公式，由以上編號(hào)1的樣品narP基因計(jì)算公式為：

根據(jù)以上計(jì)算方法，將narP、narQ在不同硝酸鹽濃度培養(yǎng)基中的相對(duì)表達(dá)倍數(shù)呈現(xiàn)于表J3中。

由表J3做柱形圖如下（圖J2）：

3 討論

3.1 多殺性巴氏桿菌硝酸鹽還原能力的測(cè)定

某些細(xì)菌能將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，亞硝酸鹽與醋酸作用，生成亞硝酸，亞硝酸與對(duì)氨基苯磺酸作用生成重氮基苯磺酸，后者與α-萘胺結(jié)合生成N-α萘胺偶苯磺酸，呈現(xiàn)紅色[4]。在實(shí)驗(yàn)中，生化管中液體呈現(xiàn)紅色，為陽(yáng)性，故該牛源A型多殺性巴氏桿菌具有還原硝酸鹽的能力。

3.2 不同濃度硝酸鹽條件下narQ、narP基因表達(dá)量的測(cè)定

由圖J2可以看出，在不同濃度硝酸鹽培養(yǎng)基中，narQ、narP基因的表達(dá)量隨硝酸鹽濃度的不同而改變。當(dāng)環(huán)境中硝酸鹽濃度在0.75-1.25 g/L時(shí)，narQ、narP基因的表達(dá)量處于一個(gè)較低水平，這可能是多殺性巴氏桿菌比較適應(yīng)的硝酸鹽濃度范圍;當(dāng)環(huán)境中硝酸鹽濃度過(guò)高或過(guò)低時(shí)，narQ、narP基因的表達(dá)量均開(kāi)始上升，以此調(diào)控環(huán)境中太高或太低的硝酸鹽濃度，使細(xì)菌通過(guò)雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)來(lái)適應(yīng)變化了的環(huán)境，這與原榮榮等報(bào)道的在大腸桿菌中NarQ-NarP信號(hào)系統(tǒng)具有調(diào)控下游與硝酸鹽相關(guān)的基因 的功能相一致[5]。圖J2還表明，narQ、narP這對(duì)雙組分元件在不同濃度的硝酸鹽環(huán)境中，其上調(diào)或下降表達(dá)的趨勢(shì)是一致的，說(shuō)明這兩個(gè)元件在多殺性巴氏桿菌的生長(zhǎng)、代謝過(guò)程的作用是相輔相成、共同作用，這與堯可等報(bào)道的典型的雙組份信號(hào)系統(tǒng)通常包括組氨酸激酶和反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白，這兩個(gè)蛋白憑借其特殊的結(jié)構(gòu)域同時(shí)發(fā)揮接受磷酸基團(tuán)和調(diào)節(jié)下游分子的作用機(jī)制相一致[6]。

3.3 結(jié)論

牛源A型多殺性巴氏桿菌具有硝酸鹽代謝的能力，在硝酸鹽代謝的過(guò)程中，該菌的NarQ-NarP雙組份信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)與硝酸鹽代謝密切相關(guān)。

參考文獻(xiàn)：

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作者簡(jiǎn)介：

黃蘭香（1972-），女（漢族），湖南常德人，博士，任職于西南大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，副教授，研究方向：主要從事動(dòng)物微生物學(xué)與免疫學(xué)的教學(xué)科研工作。

基金項(xiàng)目：

1.重慶市基礎(chǔ)與前沿研究計(jì)劃項(xiàng)目（cstc2015jcyjA80021），項(xiàng)目名稱(chēng)：牛A型巴氏桿菌NarQ-NarP調(diào)控系統(tǒng)缺失株的構(gòu)建及其生物學(xué)特性研究;

2.西南大學(xué)基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)資金項(xiàng)目（XDJK2013C015），項(xiàng)目名稱(chēng)：牛巴氏桿菌A型與B型莢膜亞單位疫苗的比較研究。

（作者單位：西南大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院）