生物質(zhì)熱解液和腐霉利混配對番茄灰霉病的防病作用及機理研究

李 泳， 吳委林， 顏塵棟， 王 薇， 韓 玉， 李熙英

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002)

番茄灰霉病是灰葡萄菌(Botrytiscinerea)侵染引起的病害，其特點是傳播速度快、危害重等[1]。20世紀80年代，灰霉病在我國零星出現(xiàn)并在短時間內(nèi)迅速蔓延開來，目前為止，該病在全國主要番茄保護地均有發(fā)生[2]。番茄灰霉病集中出現(xiàn)在我國黃淮沿海地區(qū)、東北以及西北內(nèi)陸地區(qū)的保護地，病高發(fā)期可導(dǎo)致大田番茄產(chǎn)量損失大約為總產(chǎn)量的1/3，病發(fā)的年份產(chǎn)量可損失3/4左右[3]?，F(xiàn)階段番茄灰霉病的防治主要是以腐霉利等藥劑的化學(xué)防治，但化學(xué)防治常造成《3R》問題以及污染水土、人畜中毒、農(nóng)田生態(tài)平衡與生物多樣性的破壞等一系列社會問題[4]。所以，需要尋找一種對環(huán)境友好的防治方法。

生物質(zhì)熱解液(農(nóng)廢熱解液)是利用快速熱解技術(shù)處理生物質(zhì)(秸稈、枯枝等)原料獲得的生物油精制過程中分離得到的水溶性物質(zhì)，其理化特性[5]類似于木(竹)醋液。國內(nèi)外對木醋液在植物病害防治[6-8]等方面有較多的研究報道；沈國娟等[9]研究表明，生物質(zhì)熱解液與銀法利混配可以提高辣椒疫病的協(xié)同防病作用，并能減少銀法利的用量；韓玉等[10]在生物質(zhì)熱解液與多菌量混配對水稻紋枯病的防病作用中也得到與沈國娟等相似的結(jié)論。但尚未見有關(guān)生物質(zhì)熱解液以及與化學(xué)農(nóng)藥混配對番茄灰霉病防病作用以及機理方面的研究報道。該試驗研究了生物質(zhì)熱解液和腐霉利混配對番茄灰霉病的協(xié)同防病作用及機理，為減少化學(xué)農(nóng)藥使用量的前提下防治番茄灰霉病提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1) 供試培養(yǎng)基： PDA培養(yǎng)基。

2) 供試菌種：試病原菌為番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea)，由延邊大學(xué)植物病理研究室保存。

3) 生物質(zhì)熱解液熱解液(簡稱為農(nóng)廢熱解液)：由延邊大學(xué)食品科學(xué)系提供。

4) 供試番茄品種：中蔬4號，無限生長型。

5) 50%腐霉利：日本住友化學(xué)株式會社生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 不同濃度的生物質(zhì)熱解液和腐霉利對番茄灰霉病菌的抑菌作用

采用含毒介質(zhì)培養(yǎng)法，將生物質(zhì)熱解液原液和腐霉利加入到PDA中制作生物質(zhì)熱解液濃度分別為1、2、4、5、6、8和10 mL/L的含生物質(zhì)熱解液PDA培養(yǎng)基和腐霉利濃度為0.1、0.5、0.8、1、5、8和10 mg/L的含腐霉利PDA培養(yǎng)基。含藥平板中央放置1片直徑為7 mm的番茄灰霉病菌菌餅，以純PDA為對照，重復(fù)5個培養(yǎng)皿，放入25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2 d后開始用十字交叉法測病菌菌落直徑，取對照菌落長滿平板時的數(shù)據(jù)計算抑菌率。并建立毒力回歸方程，計算EC50值。

1.2.2 生物質(zhì)熱解液與腐霉利最佳配比的篩選

以腐霉利和生物質(zhì)熱解液的EC50濃度為基準，將生物質(zhì)熱解液∶腐霉利按照10∶0、9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9、0∶10的比例混配測定抑菌率。具體試驗方法同1.2.1。若毒力比率明顯大于1，為增效作用；若毒力比率明顯小于1，為拮抗作用；毒力率為1左右，則為相加作用。計算菌落生長后連續(xù)3 d內(nèi)的毒力比率。

預(yù)期抑制生長率=(單劑A的EC50劑量實際抑制生長率×配比中的百分率)+(單劑B的EC50劑量實際抑制生長率×配比中的百分率)

采用1.2.1的方法，在前面試驗中篩選的幾組毒力比率大、有增效作用的混配建立毒力回歸方程以及計算EC50值。所得結(jié)果采用孫云沛方法(1960)計算共毒系數(shù)(CTC)[7]。若共毒系數(shù)明顯大于100表示增效作用；明顯小于100表示拮抗作用；接近100表示相加作用。

1.2.3 生物質(zhì)熱解液和腐霉利混配對番茄果實灰霉病的防病作用

選擇長勢均勻、無機械損害的平均直徑為3 cm左右的新鮮番茄果實，用自來水反復(fù)沖洗，自然晾干后用70%的酒精進行表面消毒，晾干備用。

用已滅菌的接種針在番茄果面中部刺3個傷口，每傷口處滴20 μL灰霉病菌孢子懸浮液(400倍視野100左右孢子)，待孢子懸浮液陰干后進行藥劑處理。具體為：生物質(zhì)熱解液EC50濃度、腐霉利EC50濃度、生物質(zhì)熱解液EC50濃度和腐霉利1/4 EC50濃度的混配液、生物質(zhì)熱解液EC50濃度和腐霉利1/2 EC50濃度混配液、生物質(zhì)熱解液EC50和腐霉利EC50混配濃度的1∶9混配液，每傷口處滴20 μL。每個處理24個果實，3次重復(fù)。待晾干后用保鮮膜密封保濕置于25 ℃恒溫箱中，每天進行觀察，10 d后，統(tǒng)計番茄果實上的病斑直徑、發(fā)病率，計算病情指數(shù)和防治效果。

病果分級標準[11]：病斑直徑以十字交叉法測定。

0級:無病斑;

1級:果實病斑直徑<0.5 cm;

2級:果實病斑直徑為0.6～1 cm;

3級:果實病斑直徑為1.1～1.5 cm;

4級:果實病斑直徑為1.6～2 cm;

5級: 果實病斑直徑>2 cm。

1.2.4 生物質(zhì)熱解液和腐霉利混配對番茄灰霉病菌菌絲細胞通透性的影響

稱取PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)8 d的番茄灰霉病菌菌絲進行測試。電導(dǎo)率的測定采用吳方麗等[12]人的方法；細胞蛋白質(zhì)和核酸類物質(zhì)外滲的測定參照徐俊光等[13]人的方法。處理2 h時測相應(yīng)的值。

1.2.5 生物質(zhì)熱解液和腐霉利混配對番茄灰霉病菌菌絲生理代謝的影響

稱取PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)8 d的番茄灰霉病菌菌絲進行測試?？偺呛康臏y定采用蒽酮試劑法；蛋白質(zhì)含量測定采用考馬斯亮藍G-250法[14]；蛋白酶活性測定采用福林酚法[15]；幾丁質(zhì)酶活性的測定參考Boller等[16]人的方法；β-1,3-葡聚糖酶活性的測定采用余永廷等[17]人的方法。

1.2.6 抑菌作用的顯微觀察

EC80濃度的生物質(zhì)熱解液、腐霉利及兩者混劑(1∶9)與番茄灰霉病菌進行平板抑菌試驗，培養(yǎng)4 d后，病菌菌絲生長受抑制部位用顯微鏡觀察并拍照。

1.2.7 生物質(zhì)熱解液和腐霉利混配對番茄葉片的POD、SOD、CAT的活性及葉綠素含量的的影響

春季田間移栽番茄苗。移栽時株行距為25 cm×40 cm，每株定植2株，移栽后進行正常的田間管理。緩苗1周后開始噴濃度均為EC80的腐霉利、生物質(zhì)芯熱解液、生物質(zhì)熱解液和腐霉利及兩者混劑(1∶9)，每隔7 d噴施1次，共噴2次，每棵第1次噴施的藥液量為20 mL/株，第2次噴施藥液量為40 mL/株。每個處理10株，重復(fù)3次。測定處理7 d后的番茄葉片POD、SOD、CAT酶活性和葉綠素含量。過氧化物酶(POD)的活性用略有調(diào)整的愈創(chuàng)木酚法進行測定[18]，超氧化物歧化酶(SOD)的活性用NBT法進行測定[13]，過氧化氫酶(CAT)的活性用紫外吸收法進行測定。葉綠素含量的測定采用SPAD-502葉綠素儀測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物質(zhì)熱解液和腐霉利對番茄灰霉病菌的室內(nèi)抑菌作用

由圖1可知，不同濃度的生物質(zhì)熱解液對番茄灰霉病菌均有抑菌作用，其抑菌率隨著濃度的升高有明顯增加的趨勢。當(dāng)生物質(zhì)熱解液的濃度為10 mL/L時，對番茄灰霉病菌的抑菌率為100%。

圖1 不同濃度生物質(zhì)熱解液對番茄灰霉病菌的抑制作用

由圖2可知，不同濃度的腐霉利對番茄灰霉病菌均有抑菌作用，其抑菌率隨著濃度的升高有明顯增加的趨勢。當(dāng)腐霉利的濃度為10 mL/L時，對番茄灰霉病病菌的抑菌率達到了97.09%。

根據(jù)圖1，2的數(shù)據(jù)建立的生物質(zhì)熱解液和腐霉利對番茄灰霉病菌的毒理方程和EC50值見表1。

由表1可知，毒力方程相關(guān)系數(shù)均大于0.95，說明毒力回歸方程的擬合性較好，有較大的可信度。根據(jù)毒力回歸方程求得的腐霉利和生物質(zhì)熱解液的EC50值分別為1.879 3和2.943 5 mg/L，說明生物質(zhì)熱解液和腐霉利對番茄灰霉病菌有較強抑菌作用，其中腐霉利的抑菌作用強于生物質(zhì)熱解液。

圖2 不同濃度腐霉利對番茄灰霉病菌的抑制作用

表1 生物質(zhì)熱解液與腐霉利單劑對番茄灰霉病菌的毒理測定結(jié)果

2.2 生物質(zhì)熱解液和腐霉利混配最佳配比篩選

由表2可見，生物質(zhì)熱解液和腐霉利配比為1∶9和3∶7時，毒力比率在持續(xù)的2 d均大于1，說明兩者的混配效果為協(xié)同增效作用；生物質(zhì)熱解液和腐霉利配比為2∶8時，毒力比率在1左右，說明兩者混配效果為相加作用；其它混配比下毒力比率明顯小于1，說明兩者混配效果為拮抗作用。

表2 生物質(zhì)熱解液與腐霉利最佳配比的毒力比率

續(xù)表2 生物質(zhì)熱解液與腐霉利最佳配比的毒力比率

生物質(zhì)熱解液與腐霉利1∶9和3∶7混配的毒力回歸方程、EC50值以及共毒系數(shù)(CTC)見表3。

由表3可見，相關(guān)系數(shù)均大于0.96，說明毒力回歸方程擬合的較好。當(dāng)混配比例為1∶9時的EC50值(0.85 mL/L)小于混配比例為3∶7時的EC50值(2.26 mL/L)。

根據(jù)上面所求得2種單劑的EC50值和混劑的EC50值，計算的1∶9混配的共毒系數(shù)(CTC)為296.00，明顯大于100；3∶7混配的共毒系數(shù)(CTC)為58.18，遠小于100。這進一步說明，生物質(zhì)熱解液和腐霉利1∶9配比具有明顯的增效作用。

表3 生物質(zhì)熱解液與腐霉利單劑對番茄灰霉病菌的毒理測定結(jié)果

2.3 生物質(zhì)熱解液和腐霉利混配對番茄離體果實灰霉病的防病作用

由表4可知，生物質(zhì)熱解液、腐霉利以及混劑處理的番茄果實病情指數(shù)均顯著低于對照。其中，生物質(zhì)熱解液腐霉和腐霉利1∶9混劑處理防效最高，在EC50濃度下的防效為69.36%；其次為生物質(zhì)熱解液的EC50+1/2濃度腐霉利EC50的防效，其防效為60.17%；再次為生物質(zhì)熱解液EC50+1/4濃度腐霉利EC50和EC50濃度腐霉利處理的防效，其防效分別為55.88%和55.07%；生物質(zhì)熱解液對番茄灰霉病的防效最低。從中可見，加生物質(zhì)熱解液的條件下，含25%腐霉利EC50濃度的混劑與單用EC50濃度的腐霉利單劑有相同的防效；含50%腐霉利EC50濃度時的混劑防效顯著高于只用EC50濃度的腐霉利的防效。說明生物質(zhì)熱解液與腐霉利混配對番茄灰霉病有明顯的增效防病作用和減農(nóng)藥作用。

表4 生物質(zhì)熱解液、腐霉利及混劑對番茄果實灰霉病的防病作用

注：a、b、c、d、e表示在5%水平上的差異顯著性，下同。

2.4 生物質(zhì)熱解液與腐霉利混配對番茄灰霉病菌細胞膜通透性的影響

由表5可見，不同處理的番茄灰霉病菌菌絲電導(dǎo)率值、蛋白質(zhì)和核酸類物質(zhì)外滲濃度均高于對照。其中，混劑處理過的番茄灰霉病菌絲的電導(dǎo)率值、蛋白質(zhì)和核酸類物質(zhì)外滲濃度最高，分別達到了對照的1.21倍、1.67倍和3.75倍；其次為生物質(zhì)熱解液處理的，分別達到了對照的1.15倍、1.33倍和1.61倍。說明混配對番茄灰霉病菌菌絲細胞膜的破壞性最強。

表5 生物質(zhì)熱解液與腐霉利混配對番茄灰霉病菌細胞膜通透性的影響

2.5 生物質(zhì)熱解液與腐霉利混劑對番茄灰霉病菌生理代謝的影響

由表6可知，不同處理的番茄灰霉病菌菌絲的總糖含量和蛋白質(zhì)含量顯著低于對照，其中，混劑處理總糖含量和蛋白質(zhì)含量最低，分別為對照的42.31%和62.24%；其次為2種單劑處理的總糖含量和蛋白質(zhì)含量。不同處理的番茄灰霉病菌菌絲的蛋白酶活性、幾丁質(zhì)酶活性和β-1,3-葡聚糖酶的活性顯著高于對照，其中，混劑處理的蛋白酶活性、幾丁質(zhì)酶活性和β-1,3-葡聚糖酶的活性最高，分別為對照的2.37倍、2.68倍和1.62倍；生物質(zhì)熱解液處理蛋白酶活性與混劑處理的蛋白酶活性間沒有顯著性差異。

表6 生物質(zhì)熱解液與腐霉利混配對番茄灰霉病菌生理代謝的影響

2.6 生物質(zhì)熱解液與腐霉利混配對番茄灰霉病菌菌絲形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

由圖3可知，未經(jīng)藥劑處理過的正常病菌菌絲形態(tài)結(jié)構(gòu)完整、分支明顯、呈樹枝狀、呈現(xiàn)良好的狀態(tài)；經(jīng)腐霉利處理過的病菌菌絲膨大、溶菌、嚴重彎曲、隔膜不明顯、分支減少等；生物質(zhì)熱解液處理的病菌菌絲扭曲、變形、溶菌；混配處理的病菌菌絲呈嚴重扭曲狀、膨大、溶菌、分支減少等，兼具了腐霉利和生物質(zhì)熱解液的共同特點。

注：1為正常菌絲；2為經(jīng)農(nóng)藥腐霉利處理后菌絲；3為經(jīng)生物質(zhì)熱解液處理后菌絲；4為經(jīng)混劑處理后菌絲。圖放大倍數(shù)均為1∶400

圖3 番茄灰霉病菌正常菌絲和藥劑處理后菌絲的形態(tài)

Fig.3 Normal hyphal morphology of botrytis cinerea and morphology after drug treatment

2.7 生物質(zhì)熱解液與腐霉利混配對番茄葉片防御性酶活性及葉綠素含量的影響

由表7可知，不同處理的番茄葉片中的SOD、POD、CAT酶活性和葉綠素含量均顯著高于對照。其中，混劑處理的SOD、POD、CAT酶活性及葉綠素含量最高，比對照分別提高了1.91倍、2.51倍，1.61倍和1.97倍；生物質(zhì)熱解液處理的SOD、POD、CAT酶活性和葉綠素含量分別比對照提高了1.33倍、1.53倍、1.30和1.51倍；腐霉利處理的SOD、POD、CAT酶活性和葉綠素含量分別比對照提高了1.24倍、2.15倍、1.13倍和1.04倍，其中腐霉利處理的CAT酶活性和葉綠素含量與對照間沒有顯著性差異。

表7 不同處理對番茄葉片中的POD、CAT、SOD酶活性的影響

3 討論與結(jié)論

張軍[19]和龐道睿等[20]研究發(fā)現(xiàn)，有機酸以及酚類物質(zhì)具有較強的抑菌作用；楊超博等[21]研究發(fā)現(xiàn)，生物質(zhì)熱解液具有廣譜的抑菌作用。該研究發(fā)現(xiàn)，生物質(zhì)熱解液對番茄灰霉病菌具有較強的抑菌作用，其EC50值為1.879 3 mL/L；番茄果實灰霉病的防病試驗中EC50濃度生物質(zhì)熱解液處理的防效為47.92%。說明將生物質(zhì)熱解液應(yīng)用到番茄灰霉病的防治中具有一定的應(yīng)用價值。

該試驗中，生物質(zhì)熱解和液腐霉利1∶9配比的EC50值明顯小于生物質(zhì)熱解液單劑EC50值和腐霉利單劑EC50值，且共毒系數(shù)(CTC)為296.00，明顯大于100。說明生物質(zhì)熱解液和腐霉利1∶9混配具有明顯的增效作用。番茄果實灰霉病的防病試驗中先用生物質(zhì)熱解和液腐霉利1∶9混劑處理的防效為69.36%；在混劑中減少腐霉利含量50%和75%的情況下防效仍達到了60.17%和55.88%，其中，減少腐霉利75%含量的混劑與單用腐霉利單劑有相同的防效。這進一步證明生物質(zhì)熱解液與腐霉利混劑對番茄灰霉病有明顯增效防病作用和減農(nóng)藥作用。這與沈國娟等[8]在農(nóng)廢熱解液與銀法利混用對辣椒疫病的防病作用試驗中得到的結(jié)果以及韓玉等[9]在農(nóng)廢熱解液與多菌靈混用對水稻紋枯病的防病作用試驗得到的結(jié)果基本吻合。

該試驗中，生物質(zhì)熱解液、腐霉利以及它們的混劑處理的番茄灰霉病菌菌絲電導(dǎo)率值、蛋白質(zhì)和核酸類物質(zhì)外滲濃度均高于對照。其中，混劑處理過的番茄灰霉病菌絲的電導(dǎo)率值、蛋白質(zhì)和核酸類物質(zhì)外滲濃度最高，分別達到了對照的1.21倍、1.67倍和3.75倍。這一結(jié)果與張慧茹等研究發(fā)現(xiàn)絞股藍內(nèi)生真菌JY25 發(fā)酵液可以使致病大腸桿菌的電導(dǎo)率增加，使細胞膜受到明顯破壞作用[22]基本一致。說明混配對番茄灰霉病菌菌絲細胞膜的破壞性最強。不同處理的番茄灰霉病菌菌絲的蛋白酶活性、幾丁質(zhì)酶活性和β-1,3-葡聚糖酶的活性顯著高于對照，其中混劑處理的蛋白酶活性、幾丁質(zhì)酶活性和β-1,3-葡聚糖酶的活性最高，分別為對照的2.37倍、2.68倍和1.62倍。經(jīng)生物質(zhì)熱解液和腐霉利混配處理的番茄灰霉病菌菌絲呈嚴重扭曲狀、膨大、溶菌、分支減少等，兼具了經(jīng)腐霉利和生物質(zhì)熱解液2種單劑處理的共同特點。以上可見，生物質(zhì)熱解液和腐霉利混劑的協(xié)同增效作用與對番茄灰霉病菌菌絲細胞膜的破壞性的提高有關(guān)。

該試驗中，生物質(zhì)熱解液、腐霉利以及它們的混劑處理的番茄葉片中的SOD、POD、CAT酶活性和葉綠素含量均顯著高于對照。其中混劑處理的SOD、POD、CAT酶活性及葉綠素含量最高，比對照分別提高了1.91倍、2.51倍、1.61倍和1.97倍。這與前人的研究結(jié)果基本一致[23-24]。說明生物質(zhì)熱解液和腐霉利混劑處理可以誘導(dǎo)番茄植株抗病性提高。