熱解吸-電噴霧離子源-三重四極桿質(zhì)譜法快速篩查火鍋底料和肉湯中非法添加罌粟殼

張虹艷, 石曉峰,2*, 邱國玉, 王小喬, 張彩霞, 張曉萍, 吳福祥, 許曉輝, 李晨曦, 潘秀麗

(1. 蘭州市食品藥品檢驗所, 甘肅 蘭州 730050; 2. 甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院, 甘肅 蘭州 730050)

罌粟殼為罌粟科植物罌粟(Papaversomniferum)采完鴉片后的干燥成熟果殼,具有一定的成癮性,標(biāo)志性成分為罌粟堿、那可丁、可待因、嗎啡、蒂巴因等生物堿[1]。20世紀(jì)80年代中期以來,一些不法食品生產(chǎn)經(jīng)營者在火鍋底料、調(diào)味料、肉湯中摻用罌粟殼的現(xiàn)象屢禁不止,為此2008年12月衛(wèi)生部發(fā)出《關(guān)于開展全國打擊違法添加非食用物質(zhì)和濫用食品添加劑專項整治的緊急通知》,明確將罌粟殼列入首批非食用物質(zhì)名單。國內(nèi)外文獻報道的罌粟殼檢測方法主要有氣相色譜法[2]、液相色譜法[3]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[4]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[5-14],這些方法各有其優(yōu)缺點,但共性問題是樣品前處理繁瑣。日常監(jiān)管常用的罌粟殼膠體金卡片快檢試劑盒由于其檢出限的限制,假陰性率較高。因此建立一種快速、靈敏、準(zhǔn)確檢測食品中非法添加罌粟殼的方法顯得十分必要。

熱解吸-電噴霧離子源-三重四極桿質(zhì)譜(TD-ESI-MS/MS)是目前比較先進的質(zhì)譜技術(shù)之一,與傳統(tǒng)質(zhì)譜方法相比,檢測器相同,但是取樣方法發(fā)生較大變化,傳統(tǒng)方法需要稱樣、提取、凈化、濃縮等前處理步驟,而該方法具有無需樣品前處理,快速、簡便、靈敏等優(yōu)勢,操作時只通過簡單的金屬探針接觸固體表面或液體樣品采集待測物,以高溫加熱的方式完成探針表面吸附物質(zhì)的解吸過程,解吸后的氣相物質(zhì)分子經(jīng)載氣流軌道收束并吹送至電噴霧區(qū)域,完成離子化過程,最終進入三重四極桿質(zhì)譜檢測器分析,適用于不同形態(tài)樣品的檢測[15,16]。電噴霧輔助激光解吸(electrospray-assisted laser desorption ionization, ELDI)[17]、直接實時分析(distress assessment and response tool, DART)[18]、解吸電噴霧(desorption electrospray ionization, DESI)[19]等離子源技術(shù)直接分析待測物時,受樣品尺寸以及形狀限制,且有不同程度的記憶效應(yīng),DART源檢測罌粟殼還需要簡單的樣品前處理[20]。相比而言,TD-ESI的優(yōu)勢在于使用探針取樣直接檢測,不受樣品狀態(tài)影響,無需樣品前處理過程,沒有記憶效應(yīng),更適用于現(xiàn)場的快速篩查。目前TD-ESI-MS/MS法已應(yīng)用于水果蔬菜中農(nóng)藥多殘留[21]、血漿中利他林的藥代動力學(xué)[22]、保健食品非法添加物[16]以及毒品檢測[23]等方面,得到了較為滿意的應(yīng)用效果。本研究運用TD-ESI-MS/MS技術(shù)對食品中非法添加罌粟殼的5種生物堿進行快速定性分析,能夠縮短分析時間、減少試劑耗材消耗,降低實驗成本,是一種快速、綠色、環(huán)保的分析方法。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Ultivo三重四極桿質(zhì)譜儀(美國Agilent公司), TD-ESI離子源(山東國投鴻基檢測技術(shù)股份有限公司),金屬取樣探針材質(zhì)為鎳鉻合金,線徑0.6 mm,環(huán)直徑2 mm,總長5～6 cm,伸出取樣器的長度為4 cm; MS105DU電子天平(瑞士Mettler Toledo公司), Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司);移液槍(德國Eppendorf公司)。

對照品鹽酸罌粟堿(批號:171214-201205,純度:99.9% )、那可丁(批號:171224-201304,純度:99.9% )、蒂巴因(批號:171216-201304)、嗎啡(批號:171201-201324,純度:99.1% )、可待因(批號:171203-201304,純度:97.5% ),均購自中國食品藥品檢定研究院。

火鍋底料和肉湯為當(dāng)?shù)厥称钒踩闄z樣品。

1.2 混合對照品溶液的配制

準(zhǔn)確稱取5種生物堿對照品各10.00 mg,分別用0.5%甲酸甲醇溶解并定容于10 mL容量瓶中,得到質(zhì)量濃度均為1 g/L 的5種生物堿對照品的儲備液,于-18 ℃冰箱中保存。精密吸取各對照品儲備液適量,于10 mL容量瓶中,用乙腈定容至刻度,配制成罌粟堿、那可丁、蒂巴因質(zhì)量濃度為1.0 mg/L 和嗎啡、可待因質(zhì)量濃度為5.0 mg/L 的混合對照品中間液,再用乙腈稀釋至那可丁、罌粟堿、蒂巴因質(zhì)量濃度為10 μg/L,可待因、嗎啡質(zhì)量濃度為50 μg/L 的混合對照品溶液。

1.3 儀器條件

1.3.1 熱解吸-電噴霧離子源條件

精密移取混合對照品溶液3 μL,用探針取樣,將待測物吸附于探針表面取樣環(huán),然后將探針插入加熱管,采用高溫加熱的方式完成探針表面物質(zhì)的解吸過程,解吸后的氣相物質(zhì)分子經(jīng)載氣流軌道收束并吹送至電噴霧區(qū)域。熱解吸-電噴霧離子源配有外置注射泵,推動泵內(nèi)溶劑進入離子源,通過電噴霧促進待測物離子化,最終進入三重四極桿質(zhì)譜儀檢測分析,熱解吸-電噴霧離子源工作原理如圖1所示,熱解吸-離子化-質(zhì)譜檢測整個分析過程在30 s內(nèi)即可完成。

離子源條件:注射泵流速200 μL/h,加熱解吸溫度260 ℃,注射泵溶劑為0.1%甲酸水溶液(含10 mmol/L 甲酸銨)-乙腈(1∶1, v/v)。

1.3.2 質(zhì)譜條件

正離子模式;干燥氣溫度:300 ℃;干燥氣流速:3 L/min;霧化器壓力:34.5 kPa(5 psi);毛細(xì)管電壓:4 000 V。質(zhì)譜采集參數(shù)見表1。

圖 1 熱解吸-電噴霧離子源工作原理Fig. 1 Principle of thermal desorption (TD)-ESI source

1.3.3 定性分析

精密移取混合對照品溶液3 μL,通過探針取樣,按上述儀器條件進行操作;對于固體樣品,用取樣探針的取樣環(huán)在樣品表面輕刮3～5 cm,對于液體樣品,精密移取3 μL樣品至探針取樣環(huán)。同法操作,若樣品與對照品溶液具有相同的分子離子峰和碎片離子峰,而且所選擇的碎片離子豐度比與對照品溶液的離子豐度比相一致(相對豐度>50% ,允許±10%偏差;相對豐度在20% ～50%之間,允許±15%偏差;相對豐度在10% ～20%之間,允許±20%偏差;相對豐度≤10% ,允許±50%偏差),則可判斷樣品中存在這種化合物。

表 1 5種生物堿的CAS號、化學(xué)式、監(jiān)測離子、碎裂電壓、碰撞能Table 1 CAS Nos., chemical formula, monitoring ions, fragmentor and collision energies (CEs) of five alkaloids

2 結(jié)果與討論

2.1 實驗條件考察

2.1.1 熱解吸溫度

熱解吸裝置位于離子源的前端,熱解吸溫度對離子化效率至關(guān)重要,選擇適用于待測物的熱解吸溫度保證此溫度下離子化效率最高是本實驗的關(guān)鍵因素。精密移取混合對照品溶液3 μL,以不同熱解吸溫度(240、250、260、270 ℃)連續(xù)檢測3次,計算不同熱解吸溫度下總離子流圖中5種生物堿加合響應(yīng)值的平均值,依次為 31 324、35 669、45 356 和 37 888,因此選擇260 ℃為熱解吸溫度。

圖 2 注射泵不同流速對響應(yīng)響度的影響Fig. 2 Effect of different rates of pump on the response intensitySource: TD-ESI, positive; gas temperature: 300 ℃; gas flow: 3 L/min; nebulizer: 34.5 kPa; capillary: 4000 V; temperature of thermal desorption: 260 ℃; solvent of injection: 0.1% formic acid aqueous solution containing 10 mmol/L formic ammonium-acetonitrile (1∶1, v/v).

2.1.2 注射泵流速

注射泵起到傳輸待測物使其離子化的作用,流速過高或過低均會影響離子化的效率,流速通常設(shè)置的范圍為100～200 μL/h。精密移取混合對照品溶液3 μL,以不同注射泵流速(100、150、200 μL/h)進樣測定,連續(xù)檢測3次,記錄總離子流圖(縱坐標(biāo)為5種生物堿加合響應(yīng)值,橫坐標(biāo)為采集時間)。結(jié)果如圖2所示,圖中顯示3個峰為連續(xù)測定3次的總離子流圖,每個峰即一次進樣的譜圖,每個峰包含5種生物堿峰面積的加合響應(yīng);當(dāng)注射泵流速降低時,注射泵內(nèi)溶劑單位時間內(nèi)帶動待測物進入離子源的速度降低,峰形展寬,流速越低,峰展寬越明顯;當(dāng)注射泵流速升高時,峰形改善,離子化效率提高;注射泵流速為200 μL/h時,可以兼顧峰形與離子響應(yīng)強度,因此選擇200 μL/h作為注射泵流速。

2.1.3 注射泵溶劑

分別對比水-乙腈(1∶1, v/v)、0.1%甲酸水溶液-乙腈(1∶1, v/v)、0.1%甲酸水溶液(含10 mmol/L 甲酸銨)-乙腈(1∶1, v/v) 3種注射泵溶劑對5種生物堿檢測效果的影響,發(fā)現(xiàn)0.1%甲酸水溶液(含10 mmol/L 甲酸銨)-乙腈(1∶1, v/v)作為注射泵溶劑時,5種生物堿響應(yīng)強度最高,峰形最佳,故選擇0.1%甲酸水溶液(含10 mmol/L 甲酸銨)-乙腈(1∶1, v/v)作為注射泵溶劑。

2.2 方法學(xué)驗證

2.2.1 專屬性試驗

取火鍋底料和肉湯空白基質(zhì),用探針的取樣環(huán)取樣,然后按1.3節(jié)儀器條件,將探針插入加熱管熱解吸,進而進入離子源電離并導(dǎo)入三重四極桿質(zhì)譜檢測器,考察空白基質(zhì)對檢測的干擾。結(jié)果顯示空白基質(zhì)均未檢出5種生物堿,表明空白基質(zhì)對檢測無干擾,專屬性強。

2.2.2 檢出限

精密吸取混合對照品溶液適量,逐級稀釋,分別加入火鍋底料和肉湯空白基質(zhì)中,按1.3節(jié)方法操作,至恰好能滿足3倍信噪比時,計算檢出限(LOD)?；疱伒琢虾腿鉁珒煞N不同基質(zhì)中5種生物堿的檢出限見表2,其中那可丁、罌粟堿、蒂巴因3種生物堿檢出限相同,火鍋底料中嗎啡和可待因的檢出限是肉湯檢出限5 μg/kg 的2倍,究其原因可能是因為火鍋底料基質(zhì)中含有較多油脂和其他固形物,說明樣品未經(jīng)前處理直接檢測,復(fù)雜的基質(zhì)成分會影響待測物的檢測靈敏度。

表 2 5種生物堿的檢出限Table 2 LODs for the five alkaloids

圖 3 肉湯中5種生物堿6次重復(fù)試驗的譜圖Fig. 3 MRM spectra of a mixture of the five alkaloid standards in soup by six repetitive test Rate of injection: 200 μL/h; other conditions are the same as those in Fig. 2.

2.2.3 重復(fù)性和穩(wěn)定性

精密吸取混合對照品溶液1 mL,加入5 g火鍋底料和肉湯空白基質(zhì)中,配制成那可丁、罌粟堿、蒂巴因含量均為2 μg/kg,可待因和嗎啡濃度為10 μg/kg 的加標(biāo)樣品,分別按1.3節(jié)下的方法操作,重復(fù)進樣6次,結(jié)果表明,各化合物均能重現(xiàn)。圖3是肉湯加標(biāo)樣品的重復(fù)性試驗圖譜,其中圖3a中顯示6個峰為肉湯加標(biāo)樣品連續(xù)測定6次得到的總離子流圖,每個峰包含5種生物堿的響應(yīng),圖3b-k分別為各碎片離子對的監(jiān)測譜圖,可以看出,各化合物均能重現(xiàn)。

分別在1、2、4、12、24、48 h時進樣測定,每個取樣點進樣3次,結(jié)果表明5種生物堿在1～48 h內(nèi)均可檢出,穩(wěn)定性良好,能夠滿足實驗要求。

2.3 罌粟殼膠體金卡片快檢試劑盒的靈敏度

在火鍋底料和肉湯空白基質(zhì)中添加5種生物堿對照品儲備溶液,模擬5種生物堿質(zhì)量濃度均為5、10、20、40 μg/kg 的系列陽性樣品,采用罌粟殼膠體金卡片快檢試劑盒進行檢測,T線與C線同時出現(xiàn)結(jié)果為陰性,T線不顯色為陽性。兩種食品基質(zhì)的模擬陽性樣品的快檢結(jié)果相同,結(jié)果如圖4所示,以肉湯陽性樣品為例進行分析,當(dāng)樣品中生物堿濃度小于20 μg/kg 時,膠體金卡片顯示陰性;當(dāng)樣品中生物堿濃度等于20 μg/kg 時,膠體金卡片顯示弱陽性;當(dāng)樣品中生物堿濃度大于20 μg/kg 時,膠體金卡片顯示陽性。該檢測結(jié)果與TD-ESI-MS/MS的檢出限結(jié)果進行比對,顯示其靈敏度明顯低于熱解吸-電噴霧離子源-三重四極桿質(zhì)譜檢測法。

圖 4 不同濃度生物堿膠體金卡片的快檢結(jié)果Fig. 4 Results of the five alkaloids in different contents tested by colloidal gold card

圖 5 實際樣品的測定結(jié)果Fig. 5 Detection results of the real samples Conditions are the same as those in Fig. 3.

2.4 實際樣品的檢測與驗證

檢測了50批次的火鍋底料和肉湯樣品,每個樣品重復(fù)進樣3次;發(fā)現(xiàn)一批次雞湯為陽性樣品,檢出那可丁、罌粟堿、蒂巴因、可待因4種生物堿成分,特征離子具有較好的重現(xiàn)性,結(jié)果見圖5,由于樣品未經(jīng)前處理,所以具有較高的背景響應(yīng)。為此根據(jù)DB 31/2010-2012《火鍋食品中罌粟堿、嗎啡、那可丁、可待因和蒂巴因的測定》,采用HPLC-MS/MS對實際樣品中篩查出的該批次雞湯進行檢驗,進行進一步的結(jié)果驗證,結(jié)果見表3,說明TD-ESI-MS/MS作為定性檢測的快篩方法與HPLC-MS/MS結(jié)果具有一致性,表明該方法可以作為前端的現(xiàn)場快速篩查方法。

表 3 不同方法檢測5種生物堿的結(jié)果對比Table 3 Comparison for the five alkaloids tested with different methods

3 結(jié)論

本研究建立了利用熱解吸-電噴霧離子源-三重四極桿質(zhì)譜對罌粟殼進行現(xiàn)場快速篩查的方法,該方法對固體和液體樣品均無需前處理,操作簡單快速,靈敏度高,準(zhǔn)確性好,30 s內(nèi)可以完成樣品的檢測;該儀器可以與車載設(shè)備聯(lián)合使用,具有較高的社會嵌入性,可對食品中非法添加物進行風(fēng)險預(yù)警,從源頭降低食品安全風(fēng)險。