高效液相色譜法分析植物油中9種抗氧化劑

趙慧男, 張艷俠, 薛 霞, 戴 琨, 鄭文靜, 馬 騁, 祝建華, 劉艷明*, 張 峰

(1. 山東省食品藥品檢驗研究院, 山東 濟南 250101; 2. 中國檢驗檢疫科學研究院, 北京 100176)

食品中的抗氧化劑是能夠防止或延緩食品氧化性和延長儲存期的食品添加劑,主要用于防止油脂和富脂食品的氧化酸敗,以及由氧化所導致的褪色、褐變、維生素破壞等,分為天然和人工合成兩大類。人工合成抗氧化劑因價格低廉、性質穩(wěn)定而被廣泛使用,較常用的人工合成抗氧化劑有叔丁基對羥基茴香醚(BHA)、2,6-二叔丁基對甲酚(BHT)、特丁基對苯二酚(TBHQ)、2,4,5-三羥基苯丁酮(THBP)、2,6-二叔丁基-4-羥甲基苯酚(Ionox-100)、沒食子酸丙酯(PG)、沒食子酸辛酯(OG)、沒食子酸十二酯(DG)、正二氫愈創(chuàng)木酸(NDGA)等,此類化合物為苯酚類抗氧化劑[1-3]。研究表明,高劑量使用此類人工合成抗氧化劑會造成細胞凋亡、DNA裂解等潛在健康危害,其具有一定的毒性和致癌作用[4,5]。因此,美國、日本、歐盟等國家和地區(qū)已禁止使用一些合成抗氧化劑。植物油是日常生活中必不可少的食品,我國食品安全國家標準GB 2760-2014《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》對PG、BHA、BHT、TBHQ等抗氧化劑在油脂中的最大使用量也做出了嚴格規(guī)定[6],規(guī)定BHA、BHT和TBHQ的最大使用限量為0.2 g/kg, PG的最大使用限量為0.1 g/kg,對THBP、OG、DG、NDGA、Ionox-100等其他抗氧化劑暫無規(guī)定。

目前針對BHA、TBHQ、PG等抗氧化劑的檢測方法主要有薄層色譜法[7]、比色法[7]、氣相色譜法(GC)[7,8]、氣相色譜-串聯(lián)質譜法(GC-MS)[9,10]、高效液相色譜法(HPLC)[11-13]和液相色譜-串聯(lián)質譜法(HPLC-MS)[14]。其中,薄層色譜法和比色法在定量方面存在缺陷。氣相色譜法和氣相色譜-串聯(lián)質譜法常受到化合物極性、沸點等限制,且前處理方法相對復雜、耗時長。液相色譜-串聯(lián)質譜法易受基質效應影響,定量存在局限性,且液相色譜-串聯(lián)質譜儀器昂貴,設備普及率低,限制了此方法的應用。高效液相色譜法具有普及率高、定量準確、兼容性好等特點,現(xiàn)行國家標準《食品安全國家標準 食品中9種抗氧化劑的測定》[15]包含高效液相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質譜法、氣相色譜法以及氣相色譜-質譜法和比色法,其中僅高效液相色譜法適用于PG、THBP、TBHQ等9種目標抗氧化劑的同時檢測。國標方法前處理采用正己烷溶解樣品,再用乙腈進行萃取,C18固相萃取柱凈化,整個過程繁瑣,耗時較長。實驗發(fā)現(xiàn),該方法回收率較低,且實驗過程中未加入保護劑,可能導致部分目標物損失,影響實驗結果的準確性。

針對抗氧化劑檢測過程中存在的問題,本文對目標物穩(wěn)定性進行考察,確定標準儲備溶液的儲存條件,通過添加抗壞血酸棕櫚酸酯(AP)的方式,提高目標物穩(wěn)定性和回收率;對提取溶劑、除脂方式以及凈化方式等進行討論,最終建立了一種快速、簡便、準確的高效液相色譜測定食用油中9種常用人工合成抗氧化劑的方法。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Thermo Ultimate 3000高效液相色譜儀(美國Thermo Fisher Scientific公司); AB204-S型電子天平(瑞士Mettler Toledo公司); SB-800DTD型超聲波清洗器(中國寧波新芝生物科技股份有限公司); 3-18K型冷凍離心機(德國Sigma公司); Milli-Q純水系統(tǒng)(美國Millipore公司); MS3渦旋混合器(德國IKA公司)。

TBHQ、THBP、BHT、BHA、OG、NDGA、Ionox-100、DG均購自北京曼哈格生物科技有限公司,純度≥98% , PG購自德國Dr. Ehrenstorfer公司,純度≥95% 。甲醇、乙腈(HPLC級)購自德國Merck公司,純度>99.9% ; AP購自日本TCI公司,純度>97% 。實驗所用花生油、玉米油、大豆油等植物油樣品均為市售。

1.2 實驗條件

1.2.1 標準溶液的配制

稱取9種抗氧化劑標準物質各10 mg(精確至0.1 mg),用甲醇溶解并定容至10 mL,分別配制成標準儲備液(1 mg/mL),置于棕色玻璃小瓶中,于-18 ℃冷凍保存。移取各標準儲備液,用甲醇(含50 μg/mL AP)稀釋至適當濃度,得到抗氧化劑混合標準工作液,于-18 ℃冷凍保存。

1.2.2 樣品前處理

稱取2 g樣品(準確至0.001 g),置于50 mL離心管中,加入10 mL甲醇,渦旋振蕩2 min,超聲提取20 min,以 8 000 r/min 離心5 min;用5 mL甲醇重復提取一次,合并上清液,于-18 ℃冷凍2 h除脂,用0.22 μm微孔濾膜過濾,待測。

1.2.3 色譜條件

色譜柱:Waters?XBridge色譜柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm);柱溫:35 ℃;流動相:(A)甲醇和(B)0.1%(v/v)甲酸水溶液;流速:1.0 mL/min。梯度洗脫條件:0～5 min, 50%A; 5～15 min, 50%A～80%A; 15～20 min, 80%A; 20～25 min, 80%A～90%A; 25～27 min, 90%A～50%A; 27～30 min, 50%A。進樣體積:5 μL;檢測波長:280 nm。

2 結果與討論

2.1 抗氧化劑儲存條件的優(yōu)化

在抗氧化劑檢測過程中,發(fā)現(xiàn)9種抗氧化劑混合標準儲備液于4 ℃冷藏儲存后,THBP和TBHQ響應面積迅速降低,導致定量不準,嚴重影響實驗結果。同時,這種現(xiàn)象也可能會導致實驗前處理過程中THBP和TBHQ兩種物質回收率失真,實驗結果準確度降低。因此,本文研究了抗氧化劑儲存溫度,并通過在標準物質配制和前處理過程中添加其他抗氧化劑的方式增加目標抗氧化劑穩(wěn)定性,保證實驗結果準確可靠。

2.1.1 溫度對抗氧化劑的影響

用甲醇配制10 μg/mL 混合標準溶液,分別設置常溫、4 ℃和-18 ℃ 3種儲存溫度,連續(xù)測定144 h。結果顯示:PG、NDGA、BHA、Ionox-100、OG、BHT、DG等響應強度在不同溫度下,不隨時間發(fā)生明顯變化,穩(wěn)定性較好。而THBP和TBHQ兩種物質的響應強度在常溫和4 ℃冷藏兩種儲存溫度下均發(fā)生不同程度的降低,-18 ℃冷凍時溶液中各成分含量穩(wěn)定,未發(fā)生明顯變化,其峰面積占0 h時峰面積的百分比如圖1所示,因此建議標準溶液于-18 ℃冷凍儲存。

圖 1 不同儲藏條件下THBP和TBHQ的含量變化Fig. 1 Changes of contents of THBP and TBHQ under different storage conditionsTHBP: 2′,4′,5′-trihydroxybutyrophenone; TBHQ: tert-butylhydroquinone.

2.1.2 AP對抗氧化劑的影響

9種目標物均為合成酚類抗氧化劑,其抗氧化機理為吸收氧化產(chǎn)生的自由基,阻斷自由基鏈鎖反應,將油脂被氧化產(chǎn)生的自由基轉變?yōu)榉€(wěn)定的產(chǎn)物,消除脂類氧化的自由基反應[16]。AP是一種脂溶性營養(yǎng)性抗氧化劑,其在消除機體自由基的同時,還能在金屬離子Ca2+、Fe3+等存在下,與O2反應最終生成脫氫抗壞血酸,從而消除O2或H2O2對機體的氧化損害作用,可推測AP抗氧化能力比目標物強。有文獻[17]報道AP在豬油中抗氧化能力優(yōu)于TBHQ,因此嘗試在配制溶液和提取溶液中加入AP,以改善標準物質儲存和前處理過程中THBP和TBHQ的不穩(wěn)定。

圖 2 甲醇溶劑中AP的質量濃度對THBP和TBHQ響應強度的影響Fig. 2 Effect of mass concentrations of AP in methanol on the responses of the THBP and TBHQAP: ascorbyl palmitate.

圖 3 加入AP后9種抗氧化劑響應強度的變化Fig. 3 Changes of intensities of the nine antioxidants after adding APPG: propyl gallate; NDGA: nordihydroguaiaretic acid; BHA: butylated hydroxyanisole; Ionox-100: 2,6-di-tert-butylphenol; OG: octyl gallate; BHT: butylated hydroxy toluene; DG: dodecyl gallate.

用含不同濃度AP的甲醇溶液配制9種抗氧化劑的混合標準溶液,常溫避光儲存,測定目標抗氧化劑的穩(wěn)定性。結果顯示:AP質量濃度超過5 μg/mL 時,8 h內9種抗氧化劑含量基本穩(wěn)定,8 h后THBP和TBHQ兩種成分含量快速下降;當AP濃度不低于50 μg/mL 時,144 h內THBP和TBHQ含量穩(wěn)定,其占0 h時峰面積的百分比見圖2。加入AP(50 μg/mL)后混合溶液中包括THBP和TBHQ在內的9種成分在常溫儲存條件下144 h內含量均穩(wěn)定,結果見圖3。因此,為保證實驗過程中目標物的回收率,在標準物質配制和實際樣品檢測過程中采用含50 μg/mL AP的甲醇溶液作為溶劑。

2.2 提取條件的優(yōu)化

本實驗考察了甲醇和乙腈分別作為提取溶劑時目標物的提取效率。當提取體積為10 mL、提取1次時,花生油樣品中9種抗氧化劑的回收率見圖4。結果顯示:甲醇提取目標物時的回收率為76.4% ～93.4% ,乙腈提取時的回收率為65.0% ～89.0% ,甲醇的提取效率明顯高于乙腈。推測原因可能是:對于酚類化合物,質子性溶劑有更好的提取效果,故選擇甲醇作為提取溶劑。實驗進一步對提取次數(shù)進行了考察,結果顯示,甲醇提取2次時的回收率范圍為90.1% ～102.6% ,繼續(xù)增加提取次數(shù),回收率無明顯提高,因此選擇提取2次。

圖 4 兩種提取溶劑對9種目標化合物回收率的影響Fig. 4 Effects of two extraction solvents on the recoveries of the nine target compounds

2.3 凈化條件的優(yōu)化

2.3.1 除脂方式

參考文獻[13,18]方法,對于油脂樣品多利用正己烷或冷凍等方式脫脂,本文提取溶劑為甲醇,而正己烷能部分溶解于甲醇,因此不采用正己烷進行脫脂。低溫條件下,植物油中部分雜質和不飽和脂肪酸在甲醇中溶解度低,提取液經(jīng)冷凍后過濾,能夠去除部分雜質,有利于延長色譜柱使用壽命。實驗證明,冷凍除脂前后,9種目標抗氧化劑基本沒有損失,除脂后9種目標物的回收率為90.5% ～103.1% ,因此選擇冷凍除脂。

2.3.2 固相萃取方式的優(yōu)化

植物油樣品中可能存在雜質,干擾目標物的分離,本研究首先考慮采用固相萃取方式對植物油樣品進行凈化,并通過此方式減少對色譜體系的污染。

現(xiàn)有文獻[19]研究中對于抗氧化劑的凈化多采用C18和HLB固相萃取柱,因此首先比較了上述兩種固相萃取柱凈化效果。結果顯示,抗氧化劑在C18固相萃取柱上保留較弱,9種抗氧化劑回收率均小于20% ,分析發(fā)現(xiàn),上樣過程中損失44.9% ～75.6%的目標物。原因可能為抗氧化劑大多數(shù)是極性比較強的酚類化合物,而C18固相萃取柱以十八烷基硅膠為填料,通過強疏水作用保留非極性化合物,因此對目標物保留較弱;HLB固相萃取柱凈化結果顯示,由于抗氧化劑結構的差異性,不同抗氧化劑與HLB固相萃取柱作用能力不同,其中PG、THBP、NDGA、OG、DG回收率較好,超過66.7% , TBHQ、BHA、BHT、Ionox-100回收率僅為6.9% ～43.2% ,損失較多。

氨基柱具有較強的氫鍵結合能力,其正相萃取模式適用于吸附極性化合物,因此本研究后續(xù)嘗試用氨基柱對目標物進行凈化,但結果仍不理想,僅BHA、BHT和Ionox-100回收率分別為57.0% 、31.3% 、84.8% ,氨基柱對其他目標抗氧化劑保留較強,無法洗脫下來。

研究發(fā)現(xiàn),C18、HLB和氨基柱3種固相萃取方式對9種目標抗氧化劑同時凈化回收率均不理想。因此本研究不采用固相萃取凈化方式,選擇用甲醇提取目標抗氧化劑,冷凍除脂凈化。多種植物油樣品實驗結果表明,此方法干擾較少,能夠滿足9種目標化合物分離以及定量的需求。

2.4 色譜條件的選擇

實驗比較了Waters Symmetry Shield C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)、Waters XBridge C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)和Waters Atlantis T3(250 mm×4.6 mm, 5 μm)3種色譜柱對分離效果的影響。結果顯示,在相同的色譜條件下,Symmetry Shield C18色譜柱對目標物不能很好地分離,而Atlantis T3對目標物保留較強,出峰時間較晚,導致分析時間延長。因此實驗最終選擇XBridge C18色譜柱進行分離。

表 1 9種抗氧化劑的線性方程、相關系數(shù)、檢出限和定量限Table 1 Linear equations, correlation coefficients (R2), limits of detection (LODs) and limits of quantification (LOQs) of the nine antioxidants

Y: peak area;X: mass concentration, μg/mL.

本文對流動相的水相進行了優(yōu)化,考察了采用水、0.1%甲酸水溶液和0.5%甲酸水溶液時目標物的分離情況。結果顯示:水相中不含甲酸,PG、THBP的峰形拖尾嚴重,不對稱度分別為2.61和2.84。在水相中加入甲酸后,能夠有效緩解拖尾情況,峰形得到改善,甲酸體積分數(shù)為0.1%和0.5%時峰形均較好,兩者響應峰面積無明顯區(qū)別,考慮甲酸體積分數(shù)過高會影響色譜柱壽命,因此選擇0.1%甲酸水溶液作為流動相水相。優(yōu)化條件后混合標準溶液(10 μg/mL)、空白花生油樣品和加標花生油樣品(5 mg/kg)的色譜圖見圖5。

圖 5 混合標準溶液(10 μg/mL)、空白花生油樣品和加標花生油樣品(5 mg/kg)的色譜圖Fig. 5 Chromatograms of mixed standard solution (10 μg/mL), blank peanut oil sample and peanut oil spiked sample (5 mg/kg)

2.5 線性范圍、相關系數(shù)及定量限

用甲醇(含50 μg/mL AP)逐級稀釋標準儲備液,配制質量濃度為0.1、0.5、2.0、5.0、10.0、25.0 μg/mL 的系列標準工作液。將系列標準工作液按濃度從低到高的順序進行測定,以抗氧化劑的峰面積(Y)對其質量濃度(X, μg/mL)進行線性回歸,繪制標準曲線。采用空白植物油樣品加標的方法,以信噪比(S/N)=3和10時得到的目標物含量分別定義檢出限和定量限,結果見表1。目標化合物在0.1～25.0 μg/mL 之間線性關系良好,線性相關系數(shù)(R2)均在0.999以上。

2.6 回收率和精密度

向陰性樣品中添加低、中、高3個加標水平的9種抗氧化劑,每個水平平行測定6次,得到方法的回收率及精密度,見表2。結果表明,9種抗氧化劑的加標回收率為85.3% ～104.1% ,相對標準偏差為0.3% ～5.0% 。

表 2 不同植物油中9種抗氧化劑的回收率及精密度(n=6)Table 2 Recoveries and RSDs of the nine antioxidants in different vegetable oils (n=6)

2.7 實際樣品檢測

應用本方法對市售的玉米油、調和油、花生油等20批次樣品進行分析,檢測結果為兩批次胡麻油中Ionox-100有檢出,含量分別為3.08 mg/kg 和25.6 mg/kg;一批次牡丹籽油中BHT有檢出,含量為39.0 mg/kg;兩批次紫蘇油中NDGA有檢出,含量分別為6.53 mg/kg 和16.8 mg/kg,其他種類植物油中未檢出目標化合物。

3 結論

本文在現(xiàn)有抗氧化劑研究基礎上,考察及比較了不同的提取溶劑、凈化方式及色譜條件,對植物油中9種抗氧化劑高效液相色譜法進行了優(yōu)化。本文通過對抗氧化劑穩(wěn)定性的研究,確定標準儲備溶液的儲存條件,并通過在前處理過程中添加AP的方式,提高目標物穩(wěn)定性和回收率,同時提出了一種快速、準確檢測植物油中9種常用合成抗氧化劑的方法。該方法操作簡單,快捷、準確,能夠縮短檢測時間,大大提高方法的回收率和準確度,能夠更好地為植物油市場監(jiān)管提供服務。