食品中主要霉菌毒素分析方法的研究進(jìn)展

吳鳳琪, 岳振峰*, 張 毅, 黃遠(yuǎn)祥, 溫景嵐

(1. 深圳市檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院, 廣東 深圳 518045; 2. 深圳海關(guān)食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心, 廣東 深圳 518045; 3. 深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院, 廣東 深圳 518055)

霉菌毒素是由某些生長在食品或飼料中的真菌所產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)類似的一大類二級(jí)代謝產(chǎn)物,對(duì)生物體生理功能有很強(qiáng)的影響,對(duì)人和動(dòng)物的健康會(huì)造成不同程度的危害[1]。糧食和飼料在生產(chǎn)、收獲、儲(chǔ)存及加工過程中,均容易受到霉菌的污染引發(fā)霉變[1,2]。目前全球約四分之一的糧谷類食品受到不同程度的霉菌毒素污染[3],糧谷中霉菌毒素不僅會(huì)破壞或降低其營養(yǎng)價(jià)值和風(fēng)味,而且會(huì)帶來細(xì)胞毒性、生殖毒性、免疫毒性、遺傳毒性、肝腎毒性以及致癌、致畸、致突變等毒副作用,對(duì)人和禽畜的生長及健康均構(gòu)成嚴(yán)重的威脅。近年來隨著色譜、質(zhì)譜等儀器的發(fā)展,檢出水平不斷降低,特別是傳感器技術(shù)、免疫分析法、色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)等新型檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用,可以更好地對(duì)糧谷類樣品中痕量的、高危害的霉菌毒素進(jìn)行定性、定量分析,有效地推動(dòng)了相關(guān)法律法規(guī)的規(guī)范化,從而減少霉菌毒素對(duì)人類的危害[4-7]。

1 霉菌毒素概述

有研究發(fā)現(xiàn),即使是超低劑量的霉菌毒素?cái)z入,也可以造成霉菌毒素及其代謝物在生物體內(nèi)積蓄,經(jīng)過食物鏈傳導(dǎo)后危害人體健康,造成嚴(yán)重的食品安全事故。迄今為止全球已確認(rèn)了大約400種霉菌毒素及其類似物,在糧食谷物中較為常見,其中因?qū)?dòng)物和人類有嚴(yán)重毒性作用而備受關(guān)注的霉菌毒素有黃曲霉毒素、赭曲霉毒素、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮和伏馬菌素等[8,9]。

1.1 黃曲霉毒素

黃曲霉毒素(aflatoxins, AFs)是由黃曲霉和寄生曲霉通過聚酮途徑產(chǎn)生的有毒代謝產(chǎn)物[10],其結(jié)構(gòu)類似,均含有一個(gè)雙呋喃環(huán)和一個(gè)香豆素結(jié)構(gòu),其中兩個(gè)羰基氧化學(xué)性質(zhì)活潑,容易發(fā)生氫鍵締合,毒性強(qiáng),耐高溫,不耐堿[11]?；ㄉ?、棉花、大豆、玉米及核桃等糧谷類食品在生產(chǎn)、加工、存儲(chǔ)過程常常容易受到曲霉真菌感染[3],攜帶一定量的AFs,目前科學(xué)家已經(jīng)分離鑒定出30多種AFs及其衍生物[12],其中以黃曲霉毒素B族(AFB1、AFB2)和G族(AFG1、AFG2)在糧食谷物中較為常見[13],黃曲霉毒素M族(AFM1、AFM2)在動(dòng)物體內(nèi)及其代謝物、動(dòng)物源性食品中常常檢出[14]。AFs具有免疫抑制、細(xì)胞毒性、生殖毒性、肝毒性和腎毒性等多種毒副作用,最為致命的是其強(qiáng)致癌毒性,國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)已將毒性最強(qiáng)的AFB1列入人類致癌物(第1組)[10,15,16]。

1.2 赭曲霉毒素

赭曲霉毒素(ochratoxins)是主要由多種曲霉菌和純綠青霉產(chǎn)生的有毒代謝產(chǎn)物[17],其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,耐酸性、耐高溫,存在于一些常見的農(nóng)產(chǎn)品中,如葡萄[18]、咖啡、可可[19]、谷物[20]等,可通過畜禽食用被其污染的飼料轉(zhuǎn)移至動(dòng)物源食品。赭曲霉毒素共有A、B、C、D 4種異構(gòu)體,其中,赭曲霉毒素A(ochratoxin A, OTA)對(duì)人和動(dòng)物具有強(qiáng)烈的毒副作用,如免疫抑制作用等[21],能引起不可逆性的腎功能衰竭[22];并被證實(shí)對(duì)肝臟、腎臟及泌尿系統(tǒng)具有致癌毒性作用,IRAC及世界衛(wèi)生組織(WHO)將其列入2B類致癌物[23,24]。

1.3 玉米赤霉烯酮

玉米赤霉烯酮(zearalenone, ZEN),又稱F-2毒素,首先從有赤霉病的玉米中分離得到,是一種由鐮刀菌毒素,如禾谷鐮刀菌、三線鐮刀菌等菌株污染的玉米、燕麥、小麥等谷物中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物,其具有內(nèi)酯類化學(xué)結(jié)構(gòu),性質(zhì)穩(wěn)定、耐熱性好。自然界中,ZEN可被還原成兩種非對(duì)應(yīng)立體異構(gòu)體:α-玉米赤霉烯醇(α-ZEL)和β-玉米赤霉烯醇(β-ZEL),均具有雌激素活性,其中α-ZEL的毒性為ZEN的兩倍[25,26]。該類毒素具有雌激素樣活性,ZEN大量聚集可導(dǎo)致流產(chǎn)和死胎,且嬰幼兒更易受到傷害,WHO規(guī)定每日耐受量為0.5 μg/kg[27]。動(dòng)物食用了該類毒素污染的飼料,極易引起雌激素樣效應(yīng)且可能轉(zhuǎn)移至人體,且具有生殖毒性、肝毒性和細(xì)胞毒性,具有潛在的致癌性[28]。ZEN污染主要存在于飼料、豆類、谷物、玉米的收割、儲(chǔ)藏、運(yùn)輸過程中,是污染原糧和飼料的最常見霉菌毒素。

1.4 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol, DON),又稱嘔吐毒素,主要由禾谷鐮刀菌(F. graminearum)和黃色鐮刀菌(F. culmorum)等產(chǎn)生,在小麥、大麥、燕麥、玉米等農(nóng)作物中多見,是一種分布面廣、影響較大的單端孢霉烯族化合物[29]。DON對(duì)人體和動(dòng)物均有較強(qiáng)毒性,主要體現(xiàn)在影響生命體的正常生長發(fā)育,對(duì)脾臟、心臟和肝臟等造成潛在危害[30]。DON在全球各國均有出現(xiàn),在我國主要分布于長江以南區(qū)域,其不僅污染谷類作物及其制品,并且會(huì)轉(zhuǎn)移至肉制品、內(nèi)臟及乳及乳制品、蛋等動(dòng)物源食品中[31]。DON化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定,在酸性、中性、熱中穩(wěn)定,堿性條件下易分解。

1.5 伏馬毒素

伏馬毒素(fumonisin, FUM)是一類由串珠鐮刀菌(F. moniliforme Sheld)和輪狀鐮刀菌(F. vertricillioides)在適宜的環(huán)境下產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物,是一類由多種多氫醇和丙三羧酸組成的雙酯化合物,耐熱,遇酸水解產(chǎn)物仍有部分毒性[32]。目前,伏馬毒素分離鑒別到FA1、FA2、FB1、FB2、FB3、FB4、FC1、FC2、FC3、FC4和FP1等11種,其中60%以上是FB1,其毒性也最強(qiáng),因而被IARC歸為2B類致癌物[33]。有研究證實(shí),伏馬毒素可產(chǎn)生神經(jīng)毒性、肺毒性、免疫抑制、致癌性等。據(jù)報(bào)道,我國8個(gè)省的玉米、水稻中的檢出率在28% ～100%之間,最高含量達(dá)到 15 252 μg/kg[34]。

近年來,鑒于食品中的真菌毒素污染范圍日益擴(kuò)大,各國和相關(guān)國際組織先后制定和修訂了食品中黃曲霉毒素、赭曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、伏馬毒素等真菌毒素的限量標(biāo)準(zhǔn)。我國制定了GB 2761-2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中真菌毒素限量》,但該標(biāo)準(zhǔn)未對(duì)伏馬毒素和T-2毒素制定限量。國際食品法典委員會(huì)(Codex Alimentarius Commission, CAC)則于2017年對(duì)CXS 193-1995《食品和飼料中污染物和毒素的通用標(biāo)準(zhǔn)》重新修訂,制定了食品中常見真菌毒素的最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)。歐盟、美國、日本等地規(guī)定[35]:食品中AFB1的限量范圍為0～20 μg/kg, AFs(B1+B2+G1+G2)總量的限量范圍為0～15 μg/kg; OTA的限量范圍為0.5～50 μg/kg,玉米赤霉烯酮的限量范圍為20～1 000 μg/kg,脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的限量范圍為200～2 000 μg/kg,伏馬毒素的限量范圍為200～4 000 μg/kg。以上食品中的霉菌毒素最大殘留限量法規(guī),以歐盟、日本規(guī)定的限量最為嚴(yán)格,我國對(duì)玉米赤霉烯酮也較為嚴(yán)格,其他各國對(duì)不同毒素要求各有差異。

2 霉菌毒素檢測(cè)的前處理方法

霉菌毒素對(duì)糧食谷物、膳食制品的污染率高,污染量大,污染范圍廣,且具有很強(qiáng)的毒副作用。制定和完善相關(guān)法律法規(guī)控制霉菌毒素引發(fā)的食品安全事故,需要發(fā)展高效、高靈敏、通用性好的霉菌毒素分析方法。然而,食品種類復(fù)雜多樣、基質(zhì)復(fù)雜,對(duì)霉菌毒素的準(zhǔn)確定性定量造成較大干擾;而霉菌毒素痕量、高毒,往往需要一定樣品前處理手段將其從樣品中分離、富集,再以適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn)行檢測(cè)。

圖 1 多種抗體免疫親和磁性材料的合成與分離分析AFs中的應(yīng)用[49]Fig. 1 Synthesis multiple antibody immunoaffinity & magnetic materials and applied to separate AFs[49]

2.1 液液萃取法

液液萃取(liquid-liquid extraction, LLE)利用待測(cè)物在兩種不相溶液體或相之間分配系數(shù)的差異,達(dá)到分離富集的目的。根據(jù)糧谷、飼料等樣品基質(zhì)和生物毒素化學(xué)性質(zhì)特點(diǎn),常使用有機(jī)溶劑如乙腈、三氯甲烷、叔丁基甲醚或其混合溶劑從樣品液中提取目標(biāo)物[36]。然而,傳統(tǒng)的LLE法對(duì)有機(jī)溶劑需求量大,環(huán)境保護(hù)壓力大,為此發(fā)展了基于液液萃取的新技術(shù)用于霉菌毒素的檢測(cè),如加壓液液萃取和分散液液微萃取[37,38]。其中分散液液微萃取通過少量的萃取溶劑在分散劑的幫助下,以小液滴的形式存在于整個(gè)體系中,充分接觸,將目標(biāo)物從體系中高效萃取,在食品中霉菌毒素的分析中具有有機(jī)溶劑用量少、前處理操作簡便等優(yōu)勢(shì)[39]。Zhao等[40]通過分散液液微萃取完成黃酒中多種霉菌毒素的分析,方法檢出限低于0.5 μg/kg,樣品加標(biāo)回收率在84.5% ～111.2% ,同時(shí)發(fā)現(xiàn)黃酒中霉酚酸檢出較多。Wang等[41]在分散液液微萃取過程中,耦合衍生化反應(yīng)完成植物油中AFs的一步分析。但由于液液萃取步驟繁瑣、選擇性較差且受基質(zhì)干擾影響大,在霉菌毒素的分析中應(yīng)用較少。

2.2 免疫親和技術(shù)

免疫親和層析技術(shù)能通過抗原抗體結(jié)合的高度特異性在復(fù)雜樣品基質(zhì)中選擇性捕獲霉菌毒素,再通過合適的方法使霉菌毒素解吸附,完成樣品前處理的凈化和富集,結(jié)合新型的高靈敏度儀器分析食品中痕量的霉菌毒素[42-44]。Sun等[45]采用免疫親和層析法作為前處理手段,結(jié)合HPLC-MS法分析食品中的AFs和玉米赤霉烯酮;通過組合多種單克隆抗體,制備了廣譜的霉菌毒素免疫親和層析材料,在山藥、桔梗、淫羊藿及薏仁中的加標(biāo)回收率為64.7% ～112.1% ,方法定量限為0.08-0.2 μg/kg。Iha等[46]通過免疫親和層析柱分離富集花生中的AFB1、AFB2、AFG1、AFG2,回收率為70% ～125% ,滿足美國分析化學(xué)家協(xié)會(huì)(Association of Official Analytical Chemists, AOAC)方法性能要求;Sun等[47]通過超廣譜免疫親和柱同時(shí)分離富集蟲草中的6種AFs,回收率為79.28% ～103.42% ,方法定量限為0.008～0.045 μg/kg。Jinap等[48]直接用免疫親和層析材料制備色譜柱,在線完成食品中AFs的檢測(cè)分析,其中AFB1回收率為75.7% ～92.9% , AFB2回收率為72.1% ～103.0% , AFG1回收率為76.0% ～107.9% , AFG2回收率為82.1% ～103.3% 。近日Xie等[49]以多重抗體為外層、殼聚糖為中層、磁性Fe3O4為核,制備了多抗體免疫磁性納米材料(見圖1),用于谷物、堅(jiān)果、植物油中6種AFs的分離分析;所建立方法的富集倍數(shù)達(dá)到同類免疫親和柱的60倍,靈敏度有了數(shù)量級(jí)的提升。目前免疫親和技術(shù)在食品中霉菌毒素殘留分析中得到了廣泛應(yīng)用,在我國多個(gè)食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)(如GB 5009.22-2016、GB 5009.24-2016、GB 5009.96-2016)都采用此類前處理方法。但是該技術(shù)仍然具有局限性,如單克隆抗體制備繁瑣、材料修飾復(fù)雜、抗體容易失活而需控制條件、抗體價(jià)格昂貴導(dǎo)致免疫親和層析柱價(jià)格不菲等。

2.3 固相萃取技術(shù)

固相萃取技術(shù)通過固定吸附材料對(duì)目標(biāo)組分的作用力將目標(biāo)物從試樣溶液中吸附,達(dá)到分離、凈化、富集的效果,廣泛應(yīng)用于食品中霉菌毒素的前處理過程。孟娟等[50]通過HLB柱及石墨化炭黑(GCB)富集純化糧食及其制品中6種玉米赤霉烯酮類物質(zhì)(α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、玉米赤霉烯酮、α-玉米赤霉烯醇和β-玉米赤霉烯醇),以α-玉米赤霉烯酮-d4為內(nèi)標(biāo),6種目標(biāo)物的線性范圍為0.1～50 μg/L,相關(guān)系數(shù)(R2)大于0.99,檢出限為0.1～0.2 μg/kg, 3個(gè)不同水平的平均加標(biāo)回收率為79.9% ～104.0% ,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于10% 。Huang等[51]采用HLB復(fù)合柱作為樣品富集凈化手段,分析乳制品中多種霉菌毒素,方法具有較好的準(zhǔn)確度(回收率87.0% ～109% )和重復(fù)性(RSD 3.4% ～9.9% )。傳統(tǒng)的固相萃取材料如C18復(fù)合柱、HLB復(fù)合柱,由于其吸附選擇性差、吸附容量有限,基質(zhì)抑制效應(yīng)較強(qiáng),方法靈敏度低,限制了其在食品中痕量霉菌毒素分析中的進(jìn)一步推廣[52]。分子印跡聚合物技術(shù)很好地彌補(bǔ)了傳統(tǒng)固相萃取材料選擇性不足的缺陷[52]。Cao等[53]基于分子印跡聚合物的固相萃取材料富集凈化-HPLC檢測(cè),建立生姜中OTA的檢測(cè)方法,方法回收率為87.6% ～94.5% 。Liang等[54]制備了用于選擇性富集黃曲霉毒素B1的分子印跡聚合物整體柱,分析花生中黃曲霉毒素B1殘留,加標(biāo)回收率為79.5% ～91.2% ,日內(nèi)和日間RSD分別為1.2%和4.9% ,方法檢出限能達(dá)到0.118 ng/mL。

分子印跡聚合物固相萃取材料仍然有一些缺點(diǎn),如吸附容量不足、制備復(fù)雜,但是它的出現(xiàn)為新型固相萃取材料的研發(fā)提供了思路。

3 霉菌毒素的檢測(cè)方法

樣品前處理手段盡可能將樣品中的目標(biāo)物組分從基體中分離,消除干擾,且富集到適合檢測(cè)的濃度水平。而目前用于霉菌毒素的檢測(cè)方法有:電化學(xué)分析法、酶聯(lián)免疫分析法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)、薄層色譜法(thin layer chromatography, TLC)、氣相色譜法、高效液相色譜法、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法,其中主流技術(shù)是色譜和色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)。

3.1 薄層色譜法

薄層色譜法利用真菌毒素在紫外光線產(chǎn)生的熒光,并通過熒光光度強(qiáng)弱和斑點(diǎn)大小判斷毒素類別和含量。TLC已被應(yīng)用于AFs、OTAs、ZEN等多種霉菌毒素的檢測(cè)分析[55-57]。Scott等[55]指出,高效薄層色譜法和二維薄層色譜法能縮短分析時(shí)間并提高對(duì)霉菌毒素分析結(jié)果的準(zhǔn)確度,同時(shí)對(duì)硫華菊產(chǎn)生的微克量級(jí)的AFB1和AFG1進(jìn)行了熒光衍生表征。Hoeltz等[58]用TLC聯(lián)合電感耦合檢測(cè)技術(shù)建立了花生中AFB1的檢測(cè)方法,定量限達(dá)到1.2 μg/kg,方法平均回收率為98% ,在31份花生樣品中檢出16～115 g/kg 水平的黃曲霉毒素B1。Korrapati等[59]根據(jù)AOAC方法從家畜樣品中提取AFB1,采用高效薄層色譜法分析,在4個(gè)熒光發(fā)射波長下檢測(cè)、定量,所得到的結(jié)果與酶聯(lián)免疫分析法一致。盡管如此,由于TLC檢測(cè)靈敏度受限、重復(fù)性差、不易完成自動(dòng)化且準(zhǔn)確度相對(duì)其他分析方法較差,在食品中痕量毒素分析方面應(yīng)用較少。

3.2 氣相色譜法

氣相色譜法利用惰性氣體作載氣,通過載氣將氣化樣品帶入色譜柱中,通過各個(gè)組分與固定相的分配系數(shù)的差異完成分離。毛細(xì)管氣相色譜法具有與高效液相色譜法相當(dāng)甚至更好的柱效,其具有分離效能高、方法靈敏度高、分析速度快和選擇性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。早在1988年,Goto等[60]采用毛細(xì)管氣相色譜法測(cè)定黃曲霉屬作物產(chǎn)生的AFs(AFB1、AFB2、AFG1、AFG2),其中AFB1、AFB2的檢出限為1 ng, AFG1、AFG2的檢出限為2 ng;獲得了較準(zhǔn)確的分析結(jié)果,但是受限于AFs的氣化性質(zhì)以及檢測(cè)器的性能,無法達(dá)到較高的檢測(cè)靈敏度。Yue等[61]也采用了使用電子捕獲檢測(cè)器的GC法分析中藥草及相關(guān)產(chǎn)品中的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇,通過免疫親和層析凈化后,加標(biāo)回收率為85.5% ～97.2% , RSD<6.3% ,方法檢出限能達(dá)到2 μg/kg,定量結(jié)果與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)一致。由于霉菌毒素并不都具有良好的氣化性能,限制了GC法的檢出限以及適用性,故近年來較少采用GC法或GC-MS法分析霉菌毒素。

3.3 電化學(xué)分析法

3.4 免疫分析法

免疫分析法基于抗原抗體的高度特異性結(jié)合,選擇性強(qiáng)、靈敏度高,可分為非標(biāo)記和標(biāo)記免疫分析技術(shù)。在食品中真菌毒素檢測(cè)中常用的標(biāo)記免疫分析技術(shù)是ELISA:讓抗體與酶復(fù)合物結(jié)合,然后通過顯色來檢測(cè);特異性好、靈敏度高、操作簡單[68],已經(jīng)在我國食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)(GB 5009.22-2016、GB 5009.24-2016、GB 5009.96-2016)中應(yīng)用于食品中AFs和OTA的檢測(cè)。Oplatowska等[69]以7種單克隆抗體建立了食品中AFs的酶聯(lián)免疫分析法,方法的檢測(cè)限為0.4 μg/kg,應(yīng)用于花生中AFB1的檢測(cè),定量檢測(cè)結(jié)果與液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的結(jié)果具有良好的一致性。Tsounidi等[70]和Eivazzadeh-Keihan等[71]分別利用免疫分析法的高度特異性,研發(fā)了基于免疫傳感器的毒素快速分析方法。Nabok等[72]以偏振衍射儀為基礎(chǔ)研發(fā)了一種平面波傳導(dǎo)為檢測(cè)原理的免疫傳感器,AFB1的檢出限可達(dá)0.01 ng/mL。Xie等[73]以多孔納米片作為熒光探針,設(shè)計(jì)了一種基于磁性納米顆粒的AFB1免疫傳感器,AFB1的檢出限可達(dá)0.002 ng/mL。而Bacher等[74]所研發(fā)的銀線阻抗免疫傳感器能檢測(cè)到牛奶中1 pg/mL 的AFM1。免疫分析法由于特異性強(qiáng)、靈敏度好、分析速度快、操作簡單等優(yōu)點(diǎn),在霉菌毒素的快速檢測(cè)領(lǐng)域具有很好的發(fā)展前景[75],但是它不易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化,且免疫抗體合成及修飾復(fù)雜、價(jià)格昂貴,可能會(huì)限制它在霉菌毒素分析檢測(cè)領(lǐng)域的發(fā)展。

3.5 高效液相色譜法

高效液相色譜法在食品中霉菌毒素殘留分析中也有廣泛的應(yīng)用。張曉旭等[76]采用柱后衍生-高效液相色譜法測(cè)定玉米中的伏馬菌素B1和B2,檢出限均為0.02 mg/kg,在0.1～4.0 mg/kg 范圍內(nèi),3個(gè)添加水平的平均回收率為82.5% ～89.8% 。Al-Hazmi等[77]通過HPLC法測(cè)定沙特阿拉伯市售果汁中的展青霉素和OTA,并檢出1例果汁中展青霉素超標(biāo)和5例OTA超標(biāo)。由于AFs的紫外吸收信號(hào)小,檢測(cè)靈敏度低,往往需要一些衍生化技術(shù),采用熒光分析法靈敏、準(zhǔn)確分析試樣中AFs的含量,檢測(cè)靈敏度能與色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)相媲美[78]。于彥彬等[79]在固相萃取凈化后,采用高效液相色譜柱后衍生熒光檢測(cè)花生中黃曲霉毒素(B1、B2、G1和G2),回收率為68.8% ～101% , RSD為5.0% ～7.1% , Hepsag等[80]通過HPLC柱后衍生法建立了開心果和花生中AFs的分析方法,4種AFs的定量限為0.11～0.14 μg/kg。Golge等[81]也采用柱后衍生化HPLC分析核桃中的AFs,定量限為0.106～0.374 μg/kg,在112份實(shí)際樣品中檢出43.8%的樣品含有AFS。也有通過柱前衍生化HPLC法分析AFs的實(shí)例:蘇靜華等[82]利用柱前光衍生化HPLC建立胖大海中AFs的檢測(cè)方法,檢測(cè)靈敏度高,回收率為97.06% ～99.93% 。柱前衍生化技術(shù)相對(duì)柱后衍生化更加方便、準(zhǔn)確,與GB 5009.22-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中黃曲霉毒素B族和G族的測(cè)定》技術(shù)路線一致。另外Geng等[83]在檢測(cè)器流通池方面,開發(fā)了流通池集成紫外誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器檢測(cè)AFs。

圖 2 被霉菌毒素污染的葡萄及其質(zhì)譜成像圖[94]Fig. 2 Grapes polluted by OTA and their mass spectrometry images[94]a. grape infested with A. carbonarius five days after inoculation; b. grape during cryosectioning; c-e. localization of protonated, sodiated and potassiated OTA within the grape section.

3.6 色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)

色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)兼具色譜法的高效分離和質(zhì)譜檢測(cè)器的通用性,對(duì)霉菌毒素檢測(cè)的適用性廣、靈敏度高,能完成食品或飼料中多種霉菌毒素的同時(shí)檢測(cè)[84-87]。Meerpoel等[88]采用UPLC-MS法建立了能同時(shí)分析食品和飼料中OTA和桔霉素的檢測(cè)方法,定量限分別為5.6和3.9 μg/kg,方法性能指標(biāo)滿足歐盟No. 401/2006/EC和No. 2002/657/EC指令要求。Stefanovic等[89]對(duì)比了ELISA和超高效液相色譜-質(zhì)譜(UPLC-MS)兩種檢測(cè)方法對(duì)牛奶中AFM1及玉米中AFB1的分析,兩種方法都具有特異性高和靈敏度高的特性,適用性和可靠性得到了很好的驗(yàn)證。在生物化學(xué)和體內(nèi)毒理分析中,UPLC-MS/MS對(duì)霉菌毒素的分析也得到了廣泛的應(yīng)用。González-Arias等[90]采用UPLC-MS法分析共培養(yǎng)系統(tǒng)中霉菌產(chǎn)生的OTA,發(fā)現(xiàn)未來可采用OTA甲酯作為OTA暴露水平的生物標(biāo)志物進(jìn)行研究。Han等[91]通過UPLC-MS研究了大鼠體內(nèi)OTA的體內(nèi)動(dòng)力學(xué)和生物轉(zhuǎn)化,在大鼠腎臟和脾臟中鑒定了OTA的代謝產(chǎn)物OTβ(ochratoxin β)和OTB(ochratoxin B)甲酯,證實(shí)了OTA的一種代謝途徑。近年來,為了簡化前處理步驟、縮短分析時(shí)間,實(shí)時(shí)直接分析(direct analysis in real time, DART)與UPLC-MS聯(lián)用應(yīng)用于食品中霉菌毒素的分析檢測(cè):宮小明等[92]采用利用QuEChERS技術(shù)對(duì)紅酒樣品進(jìn)行前處理,直接進(jìn)樣分析,無需色譜分離,既節(jié)省了分析時(shí)間,又減少了有機(jī)溶劑的使用,適合大批量酒樣中OTA污染殘留檢測(cè)。

3.7 質(zhì)譜成像技術(shù)

質(zhì)譜成像技術(shù)(mass spectrometry imaging, MSI)將質(zhì)譜離子掃描技術(shù)與成像技術(shù)結(jié)合,可視化呈現(xiàn)組織切片中目標(biāo)物的質(zhì)荷比(m/z)信息,再通過軟件進(jìn)行有效數(shù)據(jù)的提取、分析和歸類[93]。Hickert等[94]以基質(zhì)輔助激光解吸-飛行時(shí)間質(zhì)譜成像技術(shù)可同時(shí)鑒別被真菌毒素污染的葡萄中OTA及12種伏馬毒素(見圖2),可直觀顯示樣品被污染的程度及污染區(qū)域。De Oliveira等[95]通過花生皮和花生仁切片、制樣后,以SPI(silica plate imprinting)-MSI鑒別污染的黃曲霉毒素(B1、B2、G1和G2)的空間分布,可實(shí)時(shí)、快速鑒定堅(jiān)果中真菌污染的空間分布。Berisha等[96]采用激光解吸-高分辨質(zhì)譜成像技術(shù),在無任何樣品前處理情況下,對(duì)小麥種子中的DON毒素進(jìn)行快速篩查鑒定,質(zhì)量數(shù)誤差小于2 ppm(2×10-6),且方法分辨率不受樣品基質(zhì)中水分含量的影響。MSI檢測(cè)真菌毒素的優(yōu)勢(shì)在于,簡化(或無需)樣品前處理過程、可快速鑒別多種類毒素,且同時(shí)確定毒素樣品中的污染分布。然而MSI技術(shù)屬于典型的定性分析技術(shù),盡管鑒別篩查效率很高,但是對(duì)于初篩出的陽性樣品,后續(xù)仍需LC-MS/MS技術(shù)進(jìn)一步確證。因此,MSI在食品安全檢測(cè)中的應(yīng)用尚不廣泛。

4 小結(jié)

目前,對(duì)于食品中霉菌毒素的分析檢測(cè),已經(jīng)發(fā)展了基于液液萃取、固相萃取、磁性材料萃取和核酸適配體材料的樣品前處理技術(shù),以及基于免疫分析、傳感器技術(shù)和快速色譜-質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)的聯(lián)用,以滿足檢出限不斷提高的毒素檢測(cè)需求。但其樣品前處理步驟仍然較為繁瑣,高靈敏的定性定量檢測(cè)仍依賴于色譜及色譜-質(zhì)譜聯(lián)用等大型儀器設(shè)備,價(jià)格昂貴,普及面受限。在提高分析效率、降低成本、減少前處理步驟方面主要有以下發(fā)展趨勢(shì)。(1)研發(fā)新型高選擇性填料,例如磁性材料、功能化材料等;引入熒光標(biāo)記技術(shù)、電化學(xué)發(fā)光、納米量子點(diǎn)、微流控芯片技術(shù),提高毒素檢測(cè)前處理技術(shù)精準(zhǔn)度和操作的便利性,但新型材料的價(jià)格仍然是需要解決的難題。(2)質(zhì)譜及聯(lián)用技術(shù)的應(yīng)用日趨廣泛,降低了毒素檢測(cè)成本,縮短了分析時(shí)間,同時(shí)滿足了政府監(jiān)管部門對(duì)于毒素高通量的檢測(cè)需求,提高了監(jiān)管效能,進(jìn)一步提升了食品安全的保障能力,促進(jìn)了貿(mào)易便利化。綜上所述,食品中霉菌毒素檢測(cè)技術(shù)受到國內(nèi)外研究者和相關(guān)監(jiān)管部門的高度關(guān)注,技術(shù)發(fā)展很快,法律、標(biāo)準(zhǔn)也在不斷完善,未來將對(duì)維護(hù)食品安全和消費(fèi)者健康起到重要作用。