補(bǔ)充維生素E 和硒對圍產(chǎn)期奶牛分娩應(yīng)激和繁殖性能的影響

陳 龐，柳巨雄

（吉林大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林長春 130012）

孕期、非哺乳期到非孕期、哺乳期階段奶牛產(chǎn)后應(yīng)激是產(chǎn)后繁殖能力下降的主要原因之一。圍產(chǎn)期奶牛易患營養(yǎng)代謝性疾病、免疫功能下降和生殖性疾病。圍產(chǎn)期奶牛生殖器官以及機(jī)體內(nèi)組織的細(xì)胞代謝顯著增加，導(dǎo)致產(chǎn)生超出細(xì)胞抗氧化能力的氧化自由基（ROS）[1]。維生素E 和硒（Se）是有效的抗氧化劑和自由基清除劑。補(bǔ)充抗氧化劑可補(bǔ)償自由基負(fù)荷，增加中性粒細(xì)胞活性，促進(jìn)子宮收縮、子宮復(fù)舊，降低胎膜滯留的發(fā)生率[2]。此外，補(bǔ)充抗氧化劑還提高了牛的受精率和綿羊的胚胎存活率。在妊娠晚期和哺乳早期，奶牛機(jī)體由于分娩導(dǎo)致其處于長期的應(yīng)激狀態(tài)，導(dǎo)致奶牛采食量下降，導(dǎo)致奶牛進(jìn)入能量負(fù)平衡階段，從中恢復(fù)可能需要幾周時間。圍產(chǎn)期的營養(yǎng)調(diào)控則通過體營養(yǎng)軸提高奶牛的繁殖性能[3]。當(dāng)奶牛處于能量正平衡時卵泡內(nèi)促進(jìn)卵泡發(fā)育的胰島素樣生長因子1（IGF-1）以及血漿孕酮水平出現(xiàn)升高，并且能量正平衡可提升奶牛卵母細(xì)胞的質(zhì)量[4]。提高日糧中精料比例可改善胚胎發(fā)育[5]、胚胎孵化、胚胎伸長和干擾素的表達(dá)[6]。因此推測可以通過改善奶牛產(chǎn)后及分娩應(yīng)激來提升奶牛采食量，緩解奶牛分娩后出現(xiàn)能量負(fù)平衡狀態(tài)，從而提高奶牛的繁殖能力。本試驗旨在研究圍產(chǎn)期飼料中補(bǔ)充維生素E 和硒對奶牛氧化應(yīng)激、免疫細(xì)胞功能和產(chǎn)后繁殖性能的影響，為奶?？寡趸瘧?yīng)激及提高奶牛繁殖能力等相關(guān)研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計及日糧 試驗隨機(jī)選取吉林省某集約化牛場（3.67±0.28）歲、（1.67±0.13）胎、體況（4.0±0.5）分和泌乳量（31.54±2.71）kg/d 健康的26 頭產(chǎn)后荷斯坦牛。試驗?zāi)膛７譃樵囼灲M和對照組（n=13）。試驗組和對照組平均體重分別為（418.0±21.65）、（406.5±14.20）kg，通過獨(dú)立樣本t 檢驗顯示2 組奶牛體重之間無顯著差異。試驗組在產(chǎn)后干物質(zhì)基礎(chǔ)上添加80 IU/kg 維生素E（dl-α-生育酚乙酸酯）和0.3 mg/kg 硒（亞硒酸鈉）[7]。奶牛日糧組成及營養(yǎng)成分見表1。

表1 圍產(chǎn)期奶牛日糧組成及營養(yǎng)成分

1.2 血液樣本采集 在產(chǎn)前4 周至產(chǎn)后8 周階段，每周用10 mL 注射器通過尾靜脈穿刺采集試驗動物的血樣。肝素化的真空吸收器用于分離外周血單個核細(xì)胞（PBMC）和粒細(xì)胞。3 000 r/min 離心10 min，分離血清，保存于-80℃。

1.3 測定指標(biāo)及方法

1.3.1 氧化應(yīng)激指標(biāo) 利用南京建成公司生產(chǎn)的試劑盒進(jìn)行雙加熱法測定血清丙二醛（MDA）含量。利用生物流體在芬頓反應(yīng)產(chǎn)生的自由基影響下抑制苯甲酸鈉生成硫代巴比妥酸反應(yīng)物質(zhì)（TBARs）的能力檢測血清總抗氧化力（TAC）含量。血清超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）采用南京建成公司生產(chǎn)的試劑盒利用分光光度計進(jìn)行檢測。

1.3.2 免疫功能 吞噬細(xì)胞（PA）活性和淋巴細(xì)胞（LPA）增殖試驗根據(jù)Hallett 等[8]的研究方法進(jìn)行。

1.3.3 生殖性能 記錄產(chǎn)后第1 次發(fā)情時間，并采用冷凍精液對2 組產(chǎn)后發(fā)情奶牛進(jìn)行輸精。輸精后經(jīng)直腸檢查，記錄妊娠率等生殖變量。

1.4 統(tǒng)計分析 使用SPSS 19.0 軟件（IBM?SPSS?Statistics）進(jìn)行統(tǒng)計分析。檢測數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布（P＞0.05）。采用GLM 重復(fù)測量方差分析法分析氧化應(yīng)激和免疫變量的數(shù)據(jù)。采用Kaplan-Meier 生存率分析從產(chǎn)犢到產(chǎn)后第1 次發(fā)情的時間間隔。采用對數(shù)秩檢驗確定2 組產(chǎn)后第1 次發(fā)情間隔的統(tǒng)計差異。采用Fisher 精確檢驗法研究添加劑對妊娠率的影響。變量表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。顯著性標(biāo)準(zhǔn)為P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 維生素E 和硒對圍產(chǎn)期奶牛氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響由圖1 可知，在產(chǎn)犢前4 周，對照和試驗組奶牛血清中4 種氧化應(yīng)激指標(biāo)均無顯著性差異，分娩當(dāng)天4 種指標(biāo)均有差異。試驗組產(chǎn)后第1 周血清中MDA 含量顯著低于產(chǎn)后第8 周。產(chǎn)犢前4 周至分娩當(dāng)天2 組血清TAC 含量均急劇下降，試驗組產(chǎn)后1、2、3、6、7 周TAC 含量顯著高于對照組。產(chǎn)后第1、2、6、7、8 周2 組血清中SOD 活性差異顯著，2 組奶牛在分娩當(dāng)天時血清中SOD含量達(dá)到最高濃度。2 組奶牛產(chǎn)后第1 周和第4 周血清中CAT 含量顯著下降。在產(chǎn)后早期奶牛血清中MDA 濃度較高和TAC 水平較低，表明此時氧化應(yīng)激相對較高。

2.2 維生素E 和硒對圍產(chǎn)期奶牛血清中免疫水平的影響由圖2-A 可知，2 組PA 在產(chǎn)前4 周至產(chǎn)前2 周無顯著差異；產(chǎn)前1 周、分娩當(dāng)天、產(chǎn)后3～8 周時，試驗組PA 顯著升高。由圖2-B 可知，試驗組分娩當(dāng)天、產(chǎn)后4 周和8 周血清中LPA 均顯著高于對照組（P＜0.05）。

圖1 2 組奶牛牛血清中MDA、TAC、SOD 和CAT 含量

2.3 維生素E 和硒對圍產(chǎn)期奶牛繁殖性能的影響 如表1 所示，試驗組產(chǎn)后第1 次發(fā)情的平均間隔時間比對照組短13 d。與對照組相比，試驗組的妊娠率增加了49.8%。對數(shù)秩檢驗顯示產(chǎn)后發(fā)情恢復(fù)具有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2df1=20.03，P＜0.05）。從K-M 存活曲線來看，試驗組46.15%的奶牛在30 d 內(nèi)恢復(fù)發(fā)情，而對照組0%（圖3）。與對照組相比，試驗組奶牛的妊娠率高23.40 倍（95%CI：1.15～475.9）。

圖2 2 組奶牛血清PA（A）和LPA(B)含量

表2 維生素E 和硒的補(bǔ)充對奶牛繁殖性能的影響（n=13）

圖3 Kaplan-Meier 生存分析曲線

3 討 論

在臨床生產(chǎn)中，牛場會通過調(diào)整精粗比來平衡奶牛產(chǎn)后出現(xiàn)的能量負(fù)平衡，大量的精飼料導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)自由基生成增加，還會引起奶牛瘤胃酸中毒[9]，由此可見直接添加精飼料對緩解奶牛能量負(fù)平衡存在著弊端。有研究顯示，維生素E 及硒可以結(jié)合體內(nèi)自由基，并有效緩解產(chǎn)后應(yīng)激反應(yīng)，提升奶牛采食量[10]。本試驗提出假設(shè)，產(chǎn)后在奶牛飼料中補(bǔ)充維生素E 和硒將會抵消部分氧化應(yīng)激代謝的負(fù)面影響。奶牛體內(nèi)一些代謝產(chǎn)物可反映機(jī)體的氧化應(yīng)激程度[11]，如MDA 是脂質(zhì)過氧化的重要指標(biāo)，TAC 是抗氧化的指標(biāo)。本次試驗結(jié)果表明，試驗組奶牛血清中MDA 含量在分娩后第2 周和第4 周分別達(dá)到峰值，并在分娩前4 周逐漸升高，這與Chandra 等[12]的研究結(jié)果一致，即補(bǔ)充維生素E 和鋅后奶牛血漿中TBAR 從產(chǎn)犢前60 d 開始增加，在產(chǎn)后15 d 和30 d 達(dá)到最大值。Adela 等[6]研究顯示[13]，產(chǎn)犢前1 周機(jī)體MDA 含量逐漸升高，產(chǎn)后第1 周較哺乳后期顯著升高。產(chǎn)犢后MDA 含量的升高表明奶牛處于氧化應(yīng)激狀態(tài)。本試驗結(jié)果顯示，奶牛TAC 隨產(chǎn)期臨近呈下降趨勢，隨著產(chǎn)后時間的延長TAC 含量逐漸上升，表明試驗牛產(chǎn)犢前后存在明顯的氧化應(yīng)激。與Brezezinska 等[14]的結(jié)果一致。由于產(chǎn)犢過程導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)，體內(nèi)的自由基升高，降低了SOD 和CAT 濃度，導(dǎo)致TAC整體降低[15]；而由于產(chǎn)后泌乳量提升的需要，機(jī)體代謝率急劇上升，TAC 含量也逐漸上升。Chatterjee 等[16]試驗結(jié)果顯示，奶牛機(jī)體TAC 含量在分娩時最低，奶牛產(chǎn)后補(bǔ)充維生素E 可顯著改善TAC 含量。圍產(chǎn)期奶牛血漿α-生育酚和TAC 含量呈正相關(guān)（r=0.63）[17]，這與本次試驗中添加維生素E 的試驗組奶牛TAC 含量升高結(jié)果一致。本次試驗結(jié)果中Kaplan-Meier 生存分析曲線展示補(bǔ)充維生素E 和硒后未發(fā)情牛比例下降，且試驗組及對照組之間受胎率出現(xiàn)差異性的變化。氧化應(yīng)激指標(biāo)（SOD、CAT、TAC）以及受胎率、發(fā)情率的變化表明，圍產(chǎn)期日糧中補(bǔ)充維生素E 和硒不僅有利于奶牛提高繁殖能力，而且有利于減少氧化應(yīng)激。

Chandra 等[18]的試驗結(jié)果表明，在奶牛產(chǎn)犢前3 周內(nèi)，自由基水平的增加導(dǎo)致SOD 活性增加，補(bǔ)充維生素E 和鋅后奶牛的自由基水平逐漸下降直至產(chǎn)后60 d。Bernaucci 等[19]也得到了類似的結(jié)果。根據(jù)現(xiàn)階段的研究結(jié)果，無法解釋產(chǎn)后4 周SOD 活性上升原因。機(jī)體內(nèi)SOD 活性可以增加H2O2的生成，而CAT 和其他抗氧化物活性增加可以保護(hù)機(jī)體免受活性氧（H2O2等）的侵害，因此，CAT 和SOD 活性之間存在著相關(guān)性。本試驗結(jié)果表明，2 組的CAT 活性在產(chǎn)犢期增加，試驗組CAT 活性低于對照組，表明試驗補(bǔ)充維生素E 和硒可有效增強(qiáng)抗氧化應(yīng)激能力。

本研究結(jié)果表明維生素E 和硒對吞噬作用具有積極影響。Boxer 等[20]認(rèn)為，最佳濃度的硒對吞噬作用至關(guān)重要；而Grasso 等[21]試驗結(jié)果表明硒對中性粒細(xì)胞的吞噬能力沒有影響。據(jù)報道維生素E 的補(bǔ)充可以增強(qiáng)吞噬作用[23]。Hogan 等[22]研究顯示，產(chǎn)犢前1 周以及產(chǎn)犢前期吞噬細(xì)胞活性顯著增加。本試驗結(jié)果與此類似，從產(chǎn)犢到產(chǎn)后3 周，試驗?zāi)膛５腜A 更高。本研究結(jié)果顯示，產(chǎn)后第1 周粒細(xì)胞PA 下降，第3～8 周粒細(xì)胞PA呈極顯著上升。中性粒細(xì)胞的吞噬作用導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)呼吸急促，這對殺死被吞噬的抗原至關(guān)重要[23]。在這個過程中，氧化應(yīng)激很可能是由于吞噬細(xì)胞中自由基的泄漏而產(chǎn)生，而補(bǔ)充維生素E 和硒可以緩解這種情況[24]。本研究結(jié)果表明，補(bǔ)充維生素E 和硒增加了產(chǎn)犢時淋巴細(xì)胞的刺激指數(shù)。Mavi 等[25]研究顯示，飼料中添加維生素E 能提高仔豬對白蛋白A 刺激的淋巴細(xì)胞反應(yīng)，產(chǎn)犢前后外周血淋巴細(xì)胞有絲分裂反應(yīng)顯著降低，淋巴母細(xì)胞反應(yīng)相對較低[26]。奶牛分娩過程中高水平的炎性介質(zhì)（如前列腺素、炎性細(xì)胞因子、糖皮質(zhì)激素等激素）增加，呈現(xiàn)免疫抑制疾病。產(chǎn)犢當(dāng)天的LPA 和PA 顯著升高可能是由于產(chǎn)犢的最后1 周，是由于試驗組補(bǔ)充維生素E和硒導(dǎo)致糖皮質(zhì)醇水平下降，糖皮質(zhì)下降后LPA 和PA水平會有所增加[27]。

多數(shù)研究顯示補(bǔ)充維生素E 和硒對產(chǎn)后奶牛生殖性能的影響是可變的，在本研究中試驗組奶牛首次發(fā)情和懷孕率顯著改善。在高產(chǎn)奶牛中常見因分娩和泌乳應(yīng)激導(dǎo)致機(jī)體采食量下降，奶牛出現(xiàn)能量負(fù)平衡狀態(tài)，會使奶牛容易產(chǎn)生乏情、子宮感染和受精失敗，從而損害奶牛的繁殖性能。有研究顯示，日糧中補(bǔ)充維生素E 和硒可以改善高產(chǎn)奶牛產(chǎn)后應(yīng)激，從而緩解能量負(fù)平衡狀態(tài)[28]，緩解能量負(fù)平衡狀態(tài)后將會縮短奶牛子宮復(fù)舊時間，促進(jìn)卵泡的發(fā)育，提升繁殖效率。本試驗結(jié)果亦顯示，妊娠晚期補(bǔ)充維生素E 和硒可以提高奶牛的繁殖能力。然而補(bǔ)充維生素E 和硒對產(chǎn)后生殖性能的影響原因尚不清楚，需進(jìn)一步研究分析。

4 結(jié) 論

本試驗結(jié)果表明，圍產(chǎn)期奶牛補(bǔ)充維生素E 和硒可減輕產(chǎn)后氧化應(yīng)激反應(yīng)，提高產(chǎn)犢前后免疫細(xì)胞功能，提升產(chǎn)后發(fā)情和妊娠率。