運(yùn)輸應(yīng)激對(duì)小鼠腸道的病理?yè)p傷及Bcl-2 和Bax 表達(dá)的影響

溫宇婷，劉 犇,2*，章志濤，張?chǎng)┰?，?婷，彭瑞妮,2

（1.宜春學(xué)院 生命科學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，肉牛羊疾病控制實(shí)驗(yàn)室，江西宜春 336000；2.江西綠科農(nóng)牧科技有限公司，江西宜春 336000）

為促進(jìn)區(qū)域畜牧業(yè)的發(fā)展以及滿足當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)需求，動(dòng)物跨區(qū)域運(yùn)輸頻繁，如異地引種、畜禽的跨區(qū)域轉(zhuǎn)運(yùn)與交易等。在轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中不可避免地會(huì)引起動(dòng)物的應(yīng)激反應(yīng)及傷害[1-3]。在畜禽轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中存在著諸多的應(yīng)激因素，如顛簸搖晃、擁擠、噪音和溫濕度的改變以及運(yùn)輸途中的飼料和飲水的減少，在這些因素作用下機(jī)體會(huì)產(chǎn)生適應(yīng)性和防御性反應(yīng)，即運(yùn)輸應(yīng)激[2]。運(yùn)輸強(qiáng)度的不同對(duì)動(dòng)物產(chǎn)生的影響也會(huì)有差異，一定的應(yīng)激強(qiáng)度可以提高動(dòng)物的適應(yīng)力，若應(yīng)激源強(qiáng)度大，則可能抑制炎癥和免疫反應(yīng)，降低動(dòng)物機(jī)體的抗感染力，從而直接引發(fā)或者繼發(fā)一系列疾病[4]，如呼吸和消化系統(tǒng)疾病，降低畜禽生產(chǎn)性能，嚴(yán)重時(shí)可引起動(dòng)物死亡，造成較大的經(jīng)濟(jì)損失。

動(dòng)物機(jī)體正常組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)的維持反映在細(xì)胞增殖與細(xì)胞凋亡之間的平衡[5]。在各種凋亡調(diào)控的基因中Bcl-2 家族受到廣泛關(guān)注，其中Bcl-2 和Bax 在調(diào)控細(xì)胞凋亡過(guò)程中起重要作用。研究表明，正常情況下，Bcl-2 和Bax 蛋白在機(jī)體內(nèi)表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定，當(dāng)外界環(huán)境改變時(shí)則會(huì)引起兩者表達(dá)失衡，若Bax 表達(dá)量過(guò)多會(huì)引起B(yǎng)ax 和Bax 的同源二聚體增多，對(duì)機(jī)體細(xì)胞表現(xiàn)為促凋亡；若Bcl-2 超表達(dá)，Bax 和Bcl-2 結(jié)合的異源二聚體變多，對(duì)機(jī)體細(xì)胞表現(xiàn)為抗凋亡作用[6-7]。正常情況下腸黏膜細(xì)胞的凋亡參與腸道黏膜細(xì)胞的自我更新，在增殖和凋亡過(guò)程中保持相對(duì)穩(wěn)定才能確保腸道的正常功能，任何對(duì)細(xì)胞凋亡程序有促進(jìn)作用的因素都會(huì)影響腸道功能的正常運(yùn)作[8]。本研究通過(guò)組織切片的觀察、免疫組化定位和Western Blot 定量法，探究運(yùn)輸應(yīng)激對(duì)小鼠小腸的結(jié)構(gòu)完整性及腸細(xì)胞中Bcl-2、Bax 表達(dá)的影響，為闡明運(yùn)輸應(yīng)激對(duì)動(dòng)物腸道損害及機(jī)理提供基礎(chǔ)性資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及處理 16 只健康合格的雄性ICR 小鼠購(gòu)買于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，購(gòu)回后適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d 后隨機(jī)分為對(duì)照組和處理組，每組8 只。試驗(yàn)當(dāng)天處理組8 只小鼠放置在小鼠籠中，在35℃、160 r/min 恒溫?fù)u床的體外人工模擬運(yùn)輸應(yīng)激環(huán)境下（高溫、振蕩、噪音和擁擠等）處理2 h；對(duì)照組在24℃環(huán)境下飼養(yǎng)，除了禁食禁水外不做任何處理。試驗(yàn)結(jié)束后采取脫臼致死法將所有小鼠處死，快速剖檢致死小鼠，并對(duì)各小鼠的十二指腸、空腸和回腸進(jìn)行快速取樣，一份用PBS 小心漂洗干凈后，放入4% 的多聚甲醛溶液中固定48 h 以上，4℃保存?zhèn)溆茫灰环萦肞BS 漂洗干凈后用錫箔紙小心包裹后，放于-80℃冰箱保存用于Western Blot 檢測(cè)。

1.2 HE 染色 從固定液中切取適宜長(zhǎng)度的腸組織，自來(lái)水漂洗24 h 以上，在梯度酒精中進(jìn)行脫水處理，然后放入二甲苯酒精處理10 min，再放入二甲苯中進(jìn)行透明，處理完畢后采用混合石蠟進(jìn)行包埋、修塊。制作連續(xù)切片（厚度5 μm），每間隔10 張取1 張，攤片、烘片處理后37℃保存?zhèn)溆?。從?duì)照組和處理組每只小鼠的十二指腸、空腸、回腸中各選取5 張切片，經(jīng)二甲苯脫蠟，酒精水化后用蒸餾水浸泡，再入蘇木精染液，分化后返藍(lán)，隨后入伊紅染液，酒精脫水、二甲苯透明后封片。

1.3 免疫組織化學(xué) 從對(duì)照組和處理組的每只小鼠中各隨機(jī)選取1 張切片進(jìn)行試驗(yàn)，并隨機(jī)選取對(duì)照組、處理組各1 張切片做空白對(duì)照。二甲苯脫蠟，酒精處理，經(jīng)蒸餾水、PBS 浸泡后，將切片浸入檸檬酸緩沖液中，置于微波爐中進(jìn)行抗原修復(fù)。隨后按照兔SP 試劑盒（北京中杉金橋生物科技有限公司，SP-9001）說(shuō)明書，用過(guò)氧化物酶阻斷劑進(jìn)行阻斷，PBS 洗滌，用山羊血清工作液封閉、37℃一抗孵育2 h，Anti-Bax 抗體（艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司，ab33020）和Anti-Bcl-2 抗體（艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司，ab7973）稀釋濃度均為1:800，各腸段一抗?jié)舛纫恢?，PBS 洗滌，兔SP 試劑盒中二抗37℃孵育15 min，PBS 洗滌，用辣根酶標(biāo)記卵白素工作液37℃孵育10 min，洗滌，最后使用DAB（北京中杉金橋生物科技有限公司，ZLI-9018）顯色。經(jīng)蘇木精復(fù)染、脫水、透明，封片。試驗(yàn)重復(fù)3 次。結(jié)果判定：陽(yáng)性細(xì)胞胞漿或細(xì)胞核呈黃色或褐色。

1.4 Western Blot 總蛋白提取試劑盒（P1250）、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（P1511）購(gòu)自北京普利萊基因有限公司，按照說(shuō)明進(jìn)行總蛋白的提取及蛋白濃度的測(cè)定。將 Loading Buffer 與蛋白原液以1:3 的比例配制蛋白上樣品。上樣之前將上樣品于90℃下熱處理10 min，每孔加入15 μL 上樣品。待樣品在90 V 電壓下從濃縮膠跑至分離膠后，將電壓改至120V，直到跑完分離膠。然后在300 mA 電流下濕轉(zhuǎn)，進(jìn)行85 min。用5%的脫脂奶粉封閉2 h 后，4℃條件下進(jìn)行一抗孵育16 h，一抗Bcl-2（C-2）（SNATA CRUZ BIOTECHNOLOGYINC，sc-7382）、Bax（2D2）（SNATA CRUZ BIOTECHN OLOGYINC，sc-20067）、Mouse Anti-β-Actin（BOSTER公司，BM0627）的稀釋濃度均為1:1 000，洗膜后二抗室溫孵育2 h，山羊Anti-Mouse lgG H&L(HRP)(艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司，ab6789) 二抗稀釋濃度均為1:10 000。按照超敏化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒（US EVERBRIGHT INC，S6009）說(shuō)明操作后，用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Amershamlmager 600）拍照。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 用Image-Pro Plus 6.0 軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析，用SPSS19.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，結(jié)果記為平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差，P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著，P＞0.05 表示差異不顯著。

2 結(jié)果

2.1 小鼠小腸的病理學(xué)觀察 如圖1 所示，與對(duì)照組相比，處理組十二指腸腸黏膜上皮細(xì)胞壞死、脫落，黏膜層增厚；在空腸中可見(jiàn)明顯的腸絨毛斷裂，并伴有腸腺上皮細(xì)胞脫落；回腸固有層和腸腺周邊可見(jiàn)明顯的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。

2.2 Bcl-2 和Bax 在小鼠小腸的表達(dá)情況

2.2.1 小鼠十二指腸Bcl-2 和Bax 的表達(dá)情況 如圖2所示，對(duì)照組和處理組中Bcl-2 都呈弱表達(dá)，兩者表達(dá)情況無(wú)變化，表達(dá)部位均分布在腸絨毛的上皮細(xì)胞以及腸腺細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，在對(duì)照組還可見(jiàn)隱窩底部表達(dá)。2 組中Bax 主要在腸黏膜上皮細(xì)胞和隱窩細(xì)胞胞質(zhì)中弱表達(dá)，在杯狀細(xì)胞周邊中等表達(dá)，在壞死腸腺中高表達(dá)，處理組比對(duì)照組在腸黏膜上皮細(xì)胞中的表達(dá)增強(qiáng)。

2.2.2 小鼠空腸Bcl-2 和Bax 的表達(dá)情況 如圖3 所示，Bcl-2 在對(duì)照組中呈弱表達(dá)，在絨毛上皮細(xì)胞偶見(jiàn)表達(dá)，處理組中Bcl-2 表達(dá)增強(qiáng)，明顯可見(jiàn)在脫落的腸黏膜上皮細(xì)胞中Bcl-2 高表達(dá)，腸腺細(xì)胞胞質(zhì)也相比對(duì)照組表達(dá)增強(qiáng)。Bax 在處理組中的表達(dá)比對(duì)照組明顯增強(qiáng)，對(duì)照組中Bax 在腸腺開(kāi)口處有弱表達(dá)，處理組在腸腺細(xì)胞胞質(zhì)以及胞核處高表達(dá)，在絨毛斷裂處也高表達(dá)。處理組中Bcl-2 更多在腸絨毛表達(dá)，而B(niǎo)ax 在腸絨毛上皮細(xì)胞弱表達(dá)，在腸腺中高表達(dá)。

圖1 運(yùn)輸應(yīng)激對(duì)小鼠小腸結(jié)構(gòu)的影響

圖2 十二指腸Bcl-2 和Bax 的表達(dá)

2.2.3 小鼠回腸Bcl-2 和Bax 的表達(dá)情況 如圖4 所示，對(duì)照組中Bcl-2 中等表達(dá)，主要表達(dá)于腸黏膜上皮細(xì)胞和腸腺細(xì)胞胞質(zhì)，黏膜肌層的平滑肌細(xì)胞也有表達(dá)，Bcl-2 在處理組中表達(dá)增強(qiáng)，增生的黏膜上皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞中高表達(dá)，腸腺上皮細(xì)胞的表達(dá)也增強(qiáng)。Bax在對(duì)照組中弱表達(dá)，在少數(shù)腸黏膜上皮細(xì)胞和隱窩底部中等表達(dá)，處理組在腸黏膜上皮細(xì)胞中弱表達(dá)，但腸腺和破損的腸絨毛上皮細(xì)胞中高表達(dá)。

2.3 Bcl-2 和Bax 在小鼠小腸表達(dá)量的變化情況 如圖5、6、7 所示，與對(duì)照組相比，處理組Bcl-2 和Bax 在十二指腸中的表達(dá)均提高（P＜0.01），在回腸中表達(dá)量增加（P＜0.05），但在空腸中表達(dá)量的變化無(wú)顯著差異。3 個(gè)腸段對(duì)照組與處理組的Bcl-2/Bax 比值也無(wú)顯著差異，與對(duì)照組相比，處理組十二指腸中兩者比值呈下降趨勢(shì)，空腸和回腸處理組兩者比值高于對(duì)照組。

3 討 論

圖3 空腸Bcl-2 和Bax 的表達(dá)

圖4 回腸Bcl-2 和Bax 的表達(dá)情況

圖5 小鼠十二指腸Bcl-2（n=24）和Bax（n=24）的相對(duì)表達(dá)量

圖6 小鼠空腸Bcl-2（n=24）和Bax（n=24）的相對(duì)表達(dá)量

圖7 小鼠回腸Bcl-2（n=24）和Bax（n=24）的相對(duì)表達(dá)量

腸道含有豐富的血管網(wǎng)和大量腺體組織，是動(dòng)物消化吸收的主要器官[9]。腸道的健康及完整性對(duì)動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育和健康至關(guān)重要。有研究指出，腸道的組織形態(tài)結(jié)構(gòu)遭受破壞會(huì)導(dǎo)致腸道內(nèi)細(xì)菌和毒素透過(guò)腸黏膜進(jìn)入機(jī)體循環(huán)，促使大量炎性因子的釋放，產(chǎn)生自由基，同時(shí)會(huì)使腸道的營(yíng)養(yǎng)吸收功能受到抑制[8]。腸黏膜是腸道的第一層免疫屏障，其結(jié)構(gòu)的完整性是維持腸道功能正常的基礎(chǔ)[10]。本試驗(yàn)中，通過(guò)蘇木精-伊紅染色法發(fā)現(xiàn)運(yùn)輸應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致小腸出現(xiàn)不同程度的病理?yè)p傷，結(jié)構(gòu)完整性遭到破壞，主要表現(xiàn)為腸絨毛的斷裂、腸腺和腸黏膜細(xì)胞的脫落。十二指腸在小腸中的重要作用是分泌小腸液，運(yùn)輸應(yīng)激后可發(fā)現(xiàn)大量腸黏膜上皮細(xì)胞壞死脫落以及出現(xiàn)了腸黏膜上皮增生變厚的現(xiàn)象，這都不利于腸道的分泌功能?？漳c和回腸出現(xiàn)腸絨毛斷裂，腸腺壞死變性，并伴有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，反映出運(yùn)輸應(yīng)激對(duì)小鼠腸道造成了嚴(yán)重?fù)p傷。動(dòng)物在長(zhǎng)途運(yùn)輸后出現(xiàn)的食欲下降甚至廢絕、腹瀉等消化道疾病可能是受腸道結(jié)構(gòu)完整性受到破壞所致[4]。

Bcl-2 定位于線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核膜這些活性氧產(chǎn)生的場(chǎng)所，Bcl-2 對(duì)氧自由基產(chǎn)生影響不大，但可以防止細(xì)胞成分受到氧化損傷[5]。位于線粒體外膜上的Bcl-2 可以通過(guò)抑制谷胱甘肽向外轉(zhuǎn)運(yùn)，使線粒體巰基維持在還原狀態(tài)；負(fù)調(diào)控細(xì)胞色素c、凋亡誘導(dǎo)因子AIF 等其他促凋亡因子的表達(dá)；通過(guò)改變凋亡蛋白酶激活因子Apaf-1 的結(jié)構(gòu)抑制凋亡蛋白酶的激活等途徑來(lái)組織細(xì)胞的凋亡與氧化[11]。Bax 則通過(guò)從胞漿轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體膜上，改變線粒體膜結(jié)構(gòu)，促進(jìn)細(xì)胞色素c 的釋放，誘導(dǎo)凋亡[12]。Bax 和Bcl-2 是一對(duì)互為拮抗的蛋白，它們之間的共同作用決定著細(xì)胞的死亡[13]。本試驗(yàn)中免疫組化結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠Bcl-2 和Bax 在腸道內(nèi)有弱表達(dá)；運(yùn)輸處理2 h 小鼠十二指腸中2 個(gè)蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化，空腸和回腸中Bcl-2 在腸絨毛斷裂、腸黏膜上皮細(xì)胞增生及黏膜上皮細(xì)胞破損處表達(dá)增強(qiáng)；處理組中Bax 在空腸和回腸的腸腺細(xì)胞胞漿中高表達(dá)，相比于對(duì)照組明顯增強(qiáng)，說(shuō)明這些部位進(jìn)行激烈的凋亡和抗凋亡作用，而上述部位又是腸道行使相關(guān)功能的主要部位。Western Blot 試驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，處理組2 種蛋白除了空腸表達(dá)增加不明顯外，其他2 個(gè)腸段（十二指腸和回腸）Bcl-2 和Bax 的表達(dá)量都顯著增加。十二指腸中Bcl-2/Bax 比值稍下降，而空腸和回腸Bcl-2/Bax 比值略微上升，這同以往研究表明應(yīng)激引起B(yǎng)cl-2/Bax 比值降低的結(jié)果有出入[14]，可能是本試驗(yàn)運(yùn)輸2h 未引起機(jī)體強(qiáng)烈反應(yīng)。

雖然運(yùn)輸2 h 提高了Bax 表達(dá)量，但是應(yīng)激的本質(zhì)是機(jī)體適應(yīng)環(huán)境做出的適應(yīng)性反應(yīng)，應(yīng)激反應(yīng)實(shí)際上是一個(gè)適應(yīng)和抵抗適應(yīng)的發(fā)生發(fā)展過(guò)程[15]。有學(xué)者指出，運(yùn)輸應(yīng)激對(duì)細(xì)胞因子產(chǎn)生的影響呈時(shí)間依賴性[16]。研究表明，動(dòng)物處于應(yīng)激狀態(tài)時(shí)減少胰島素的分泌有利于降低應(yīng)激源對(duì)機(jī)體的作用，而糖皮質(zhì)激素、胰高血糖素、IL-6 等的分泌和運(yùn)輸過(guò)程中的禁食處理會(huì)抑制胰島素分泌[17]。許利凡等[18]研究發(fā)現(xiàn)，夏南牛在運(yùn)輸2 h 后血清中促腎上腺皮質(zhì)激素和皮質(zhì)醇較運(yùn)輸1 h 顯著上升，促腎上腺皮質(zhì)激素能夠促進(jìn)糖皮質(zhì)激素的分泌。促腎上腺皮質(zhì)激素和皮質(zhì)醇在運(yùn)輸應(yīng)激中的增加都有利于減少胰島素的分泌，從而減輕應(yīng)激原的作用，保護(hù)機(jī)體，影響機(jī)體在應(yīng)激反應(yīng)中細(xì)胞凋亡程序的發(fā)展。劉犇[19]研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)輸2 h 后的山羊空腸HSP70 表量達(dá)比運(yùn)輸6 h 后顯著增加。HSP70 作為體內(nèi)的分子伴侶蛋白，在動(dòng)物發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)時(shí)通過(guò)抗凋亡作用對(duì)細(xì)胞起到保護(hù)作用[20]。以上研究表明機(jī)體處于運(yùn)輸應(yīng)激狀態(tài)時(shí)機(jī)體可以通過(guò)調(diào)節(jié)體內(nèi)激素、炎癥因子、相關(guān)蛋白等的表達(dá)和分泌對(duì)抗應(yīng)激，保護(hù)機(jī)體。運(yùn)輸2 h 動(dòng)物可能正處于對(duì)抗應(yīng)激狀態(tài)，腸道內(nèi)凋亡蛋白和抗凋亡蛋白同時(shí)升高，在體內(nèi)進(jìn)行激烈抵抗。但是隨著運(yùn)輸時(shí)間的增加，機(jī)體分泌調(diào)節(jié)的能力下降，動(dòng)物體內(nèi)的凋亡率可能也會(huì)隨之上升。運(yùn)輸應(yīng)激的產(chǎn)生、調(diào)控以及動(dòng)物機(jī)體和運(yùn)輸應(yīng)激之間的作用極為復(fù)雜，抗凋亡與促凋亡之間可能存在著轉(zhuǎn)變，而這個(gè)轉(zhuǎn)變很大程度上取決于應(yīng)激的時(shí)間與強(qiáng)度。

綜上所述，35℃、160 r/min 處理2 h 會(huì)對(duì)小鼠小腸結(jié)構(gòu)的完整性造成較為嚴(yán)重的損傷，損傷部位主要是腸絨毛和腸腺等腸道行使功能的部位；Bcl-2 和Bax 在小腸不同腸段中都有表達(dá)，在該強(qiáng)度的運(yùn)輸應(yīng)激下，處理組十二指腸和回腸Bcl-2 和Bax 的表達(dá)量明顯高于對(duì)照組，空腸和回腸Bcl-2/Bax 比值運(yùn)輸后有升高趨勢(shì)，十二指腸Bcl-2/Bax 比值降低，可見(jiàn)，運(yùn)輸后腸道Bcl-2、Bax 的表達(dá)以及Bcl-2/Bax 比值發(fā)生了變化，表明運(yùn)輸應(yīng)激對(duì)腸道的損傷作用與細(xì)胞凋亡途徑有關(guān)，可通過(guò)Bcl-2 和Bax 蛋白進(jìn)行調(diào)節(jié)。