水通道蛋白4在腸道病毒71引起的手足口病患兒口腔黏膜中的表達及臨床價值

肖青鋒，邴小三

手足口病是一種傳染性病毒性疾病，主要對象為嬰幼兒[1]。該疾病主要表現(xiàn)為發(fā)熱，手、足、臀部水皰疹，口腔黏膜潰瘍。手足口病的暴發(fā)主要由兩種腸道病毒引起：腸道病毒71和柯薩奇病毒A16。通常，手足口病是自限性的，但小部分兒童可能會經(jīng)歷嚴(yán)重的并發(fā)癥，如腦膜炎、腦炎、急性遲緩性麻痹和神經(jīng)源性肺水腫[2-3]。因此，對手足口病的發(fā)病機制、診斷和治療的研究仍然具有重要的臨床意義。病毒侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)可引起腦水腫和損傷，可進一步誘發(fā)交感神經(jīng)興奮、兒茶酚胺釋放、全身炎性反應(yīng)和免疫損傷，并最終導(dǎo)致神經(jīng)源性肺水腫和其他嚴(yán)重并發(fā)癥。水通道蛋白（aquaporin，AQP）是跨膜通道蛋白，能使水和其他小溶質(zhì)（如甘油）在細胞間選擇性轉(zhuǎn)運[4]。已證實水通道蛋白4（aquaporin 4，AQP-4）與腦水腫的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[5]。本研究旨在通過檢測兒童腸道病毒71相關(guān)手足口病患兒口腔黏膜中AQP-4的表達，為臨床判斷病情和預(yù)后提供幫 助。

1 材料與方法

1.1 一般資料

本研究選取2016年1月－2019年1月襄陽市中心醫(yī)院收治的100例腸道病毒71引起的手足口病患兒為病例組，同期入院體檢的100例健康兒童為對照組。根據(jù)中國手足口病防治指南，對100例腸道病毒71引起的手足口病患兒進行臨床分期。

1.1.1 入組標(biāo)準(zhǔn)①符合診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]的腸道病毒71引起的手足口病患兒；②年齡3～12歲，性別不限；③健康兒童無呼吸道疾病史；④健康兒童無手足口病接觸史；⑤臨床資料完整者。

1.1.2 排除標(biāo)準(zhǔn)①合并風(fēng)疹者；②合并皰疹性咽峽炎者；③合并神經(jīng)源性肺水腫者；④合并惡性腫瘤者。

1.2 研究方法

1.2.1 檢測方法患兒入院后常規(guī)水銀體溫計檢測患兒體溫，電子血壓計測量血壓，治療前，從口腔處獲取口腔黏膜樣本，清晨空腹?fàn)顟B(tài)下從肘關(guān)節(jié)處抽取靜脈血5 mL；治療7 d后，從口腔處獲取口腔黏膜樣本，空腹?fàn)顟B(tài)下從肘關(guān)節(jié)處抽取靜脈血5 mL。健康兒童于入院后按照相同操作采集口腔黏膜樣本和血液樣本5 mL。所取得的口腔黏膜、血液樣本立即送往實驗室采用商業(yè)酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）測定C反應(yīng)蛋白（CRP）、肌酸激酶（creatine kinase，CK）、肌酸激酶同工酶（creatine kinase isoenzyme，CK-MB）、AQP-4和神經(jīng)原特異性烯醇化酶（neuron-specific enolase，NSE）的水平，所有測定均按照ELISA說明書進行，所有樣品均一式兩份。檢測儀器為美國Bio-Bad全自動酶標(biāo)儀，AQP-4試劑盒購于中國武漢博士德生物工程有限公司，CRP、CK、CK-MB、NSE試劑盒購自美國R&D公司。

1.2.2 觀察指標(biāo)①搜集兩組兒童性別、年齡等基線資料并進行比較；②比較兩組兒童血清CRP、CK、CK-MB表達水平；③比較兩組兒童血清、口腔黏膜中的AQP-4表達水平；④比較不同臨床分期患兒治療前基線資料；⑤比較不同臨床分期患兒治療前后口腔黏膜中AQP-4表達水平和NSE表達水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

本研究中數(shù)據(jù)全部采用SPSS 20.0統(tǒng)計分析軟件（美國IBM公司）進行處理；計量資料采用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，多組間比較采用單因素方差分析或者重復(fù)測量的方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；計數(shù)資料采用百分率（%）表示，多組間比較采用χ2分析；P＜0.05為差異存在統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 健康兒童與手足口病患兒基線資料比較

調(diào)查結(jié)果顯示，兩組兒童年齡、性別等基礎(chǔ)資料差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞ 0.05），病例組患兒平均病程（92.8±20.2）d，見表1。

2.2 健康兒童與手足口病患兒血清CRP、CK、CK-MB水平比較

病例組患兒血清CRP、CK、CK-MB水平均高于對照組，且兩組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表1健康兒童與手足口病患兒基礎(chǔ)資料比較Table 1 Baseline data of the children with hand，foot，and mouth disease versus healthy children

表2健康兒童與手足口病患兒血清CRP、CK、CK-MB水平比較Table 2 Serum levels of C-reactive protein，creatine kinase，and creatine kinase isoenzyme in healthy children versus children with hand，foot，and mouth disease

2.3 健康兒童與手足口病患兒血清、口腔黏膜中的AQP-4表達水平比較

病例組患兒血清、口腔黏膜中的AQP-4表達水平均高于對照組，且兩組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表3健康兒童與手足口病患兒血清、口腔黏膜中的AQP-4表達水平比較Table 3 AQP-4 expression levels in serum and oral mucosa of healthy children versus children with hand，foot，and mouth disease

2.4 不同臨床分期患兒治療前后口腔黏膜中AQP-4表達水平比較

治療前，不同疾病分期患兒口腔黏膜中AQP-4表達水平由低到高依次為臨床1期、2期、3期，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；治療后，不同疾病分期患兒口腔黏膜中AQP-4表達水平均低于治療前相應(yīng)各期，且由低到高依次為臨床1期、2期、3 期，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表4。

表4不同臨床分期手足口病患兒治療前后口腔黏膜中AQP-4表達水平比較Table 4 AQP-4 expression levels in oral mucosa of children with hand，foot，and mouth disease in terms of clinical stage before and after treatment

2.5 不同臨床分期患兒治療前后口腔黏膜中NSE表達水平比較

治療前，不同臨床分期患兒口腔黏膜中NSE表達水平由低到高依次為臨床1期、2期、3期，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；治療后，不同臨床分期患兒口腔黏膜中NSE表達水平均低于治療前相應(yīng)各期，且由低到高依次為臨床1期、2期、3 期，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表5。

表5不同臨床分期患兒治療前后口腔黏膜中NSE表達 水平比較Table 5 Neuron-specific enolase expression levels in oral mucosa of children in terms of clinical stage of hand，foot，and mouth disease before and after treatment

3 討論

手足口病是一種常見的傳染病，主要感染10歲以下的兒童，主要臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、手、腳、臀部水皰疹、口腔黏膜潰瘍。大多數(shù)癥狀是自限性和輕度的，潛伏期為3～6 d，早期癥狀是低熱、咳嗽和喉嚨痛，逐漸惡化為虛弱和食欲不振。在最初的癥狀之后，發(fā)疹開始時是帶有水皰的丘疹，最后變成潰瘍。病變通常發(fā)生在口腔內(nèi)，包括頰黏膜、硬腭、面頰表面、牙齦和舌頭，而手掌和腳底，臀部和生殖器區(qū)域偶爾也會出現(xiàn)病變[7]。即使在手足口病期間臨床特征相似，某些特定方面也經(jīng)常與特定病毒相關(guān)。在腸道病毒71引起的感染中，皮疹本質(zhì)上是瘀點和/或丘疹，主要分布在軀干和四肢。手足口病可導(dǎo)致嚴(yán)重的并發(fā)癥，包括肌陣攣發(fā)作、震顫、眼球震顫、腦干腦炎和脊髓灰質(zhì)炎樣麻痹性疾病。在某些情況下，還觀察到心動過速、肺水腫/出血和心肺衰竭導(dǎo)致的立即死亡。手足口病目前還沒有有效的治療藥物或疫苗接種。因此，制定有效遏制手足口病的預(yù)防和治療措施已成為許多國家的研究重點。

AQP是一個新發(fā)現(xiàn)的膜通道蛋白家族。1994年，Agre和Verkman的研究小組獨立報告說，大腦表達了一種相當(dāng)高量的AQP cDNA，這種AQP被稱為汞不敏感水通道，后改名為AQP-4，免疫定位于整個大腦的室管膜細胞和星形膠質(zhì)細胞。迄今為止，在哺乳動物組織中發(fā)現(xiàn)了13種AQP，這些蛋白在調(diào)節(jié)跨細胞膜的水流中起著重要作用[8]。AQP功能失調(diào)是導(dǎo)致某些疾病的原因，這些疾病與水平衡失調(diào)或自身免疫有關(guān)[9-10]。目前，AQP作為治療學(xué)潛在的藥物靶點的相關(guān)性已被廣泛認(rèn)可。免疫細胞化學(xué)顯示，AQP-4在鄰近腦微血管或腦表面皮亞爾覆蓋的星形細胞質(zhì)膜區(qū)域特別豐富。AQP-4也包含在突觸周圍的星形細胞中，但水平要低得多，即星形膠質(zhì)細胞不僅在解剖學(xué)上，而且在蛋白質(zhì)表達方面，都是高度極化的細胞。AQP-4是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要AQP，就人體定位而言，AQP-4在星形膠質(zhì)細胞和與血管或腦脊液密切接觸的不同組織中表達。AQP-4是大腦中最豐富的分子之一，在血-腦、腦脊液界面的星形細胞膜中尤為普遍。盡管AQP-4與許多病理生理過程有關(guān)，但它在大腦生理學(xué)中的作用仍不明確。近期有證據(jù)表明，AQP-4參與了細胞外空間容量調(diào)節(jié)、鉀緩沖、腦脊液循環(huán)、間質(zhì)液吸收、廢物清除、神經(jīng)炎癥、滲透感覺、細胞遷移和鈣信號傳導(dǎo)等多種功 能。

近年來，AQP-4作為一種新的有希望的治療靶點，引起了人們的極大關(guān)注。AQP-4在血-腦界面的高密度表達促使人們假設(shè)AQP-4控制著血-腦之間的水流量。哺乳動物大腦中最重要的AQP是AQP-4，其與大腦水腫和損傷密切相關(guān)[11-13]。國外研究團隊發(fā)現(xiàn)，在AQP-4基因敲除后，缺血后腦水腫大大減少；在中風(fēng)大鼠中的研究發(fā)現(xiàn)，AQP-4的表達與腦水腫嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，抑制AQP-4可有效緩解腦水腫；另有研究表明，外傷性腦損傷患者腦脊液中AQP-4水平顯著升高，AQP-4是評價外傷性腦水腫腦水代謝的靈敏的生化指標(biāo)?，F(xiàn)已證實AQP-4與多種水平衡紊亂（即耳聾、腦水腫形成、癲癇和狼瘡性腦炎）有關(guān)[14-16]，在人類癲癇中，發(fā)現(xiàn)紅細胞膜透水性有缺陷；在肌萎縮側(cè)索硬化癥中，膠質(zhì)細胞維持的腦內(nèi)穩(wěn)態(tài)的失敗被認(rèn)為是神經(jīng)細胞死亡的基礎(chǔ)，在肌萎縮側(cè)索硬化癥的大鼠模型中發(fā)現(xiàn)了AQP-4的上調(diào)；除了在腦內(nèi)水轉(zhuǎn)運和離子穩(wěn)態(tài)中的作用外，AQP-4還被證實影響包括β淀粉樣蛋白在內(nèi)的腦實質(zhì)蛋白的清除。這些新的研究支持AQP-4介導(dǎo)的水轉(zhuǎn)運強烈影響大腦中代謝物和離子的清除，不僅在腦內(nèi)水平衡中起著重要作用，而且對腦實質(zhì)分子清除也具有一定影響。腦功能不全是手足口病患兒嚴(yán)重并發(fā)癥的先決條件，為此提出假設(shè)AQP-4可能參與手足口病患兒腦水腫和損傷的病理過程。該病臨床2期是神經(jīng)系統(tǒng)受累期；臨床3期是心肺功能衰竭前期，極大多數(shù)在5歲以下，尤其1～3歲兒童發(fā)病后易轉(zhuǎn)入臨床2、3期。本研究發(fā)現(xiàn)，腸道病毒71引起的手足口病患兒口腔黏膜中AQP-4表達水平高于健康兒童，且AQP-4表達水平隨著疾病嚴(yán)重程度的增加而增加，治療后AQP-4表達水平降低，推斷AQP-4可能通過調(diào)控血-腦之間的水流量參與腸道病毒71引起的手足口病的發(fā)生、發(fā)展[17-18]。

綜上所述，口腔黏膜中AQP-4表達水平與腸道病毒71引起的手足口病發(fā)生、發(fā)展以及預(yù)后相關(guān)。本研究的不足之處是受試者中沒有3歲以下病例，該年齡段的病例收集工作將在后續(xù)研究中開 展。