不同化學(xué)型互葉白千層優(yōu)良單株選擇及種質(zhì)資源分子鑒別①

覃子海 唐慶蘭 梁忠云 肖玉菲 張 燁 張曉寧 劉海龍

(廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院/國家林業(yè)局中南速生材繁育實(shí)驗(yàn)室/廣西優(yōu)良用材林資源培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣西南寧530002)

互葉白千層是桃金娘科（Myrlaceaca）白千層屬（Melaleuca）常綠灌木或小喬木樹種，原產(chǎn)于澳大利亞東部的昆士蘭州和新南威爾士的北部。由于互葉白千層枝葉中含有α-松油烯，桉葉素，γ-松油烯，4-松油醇等多種揮發(fā)性成分，長期以來作為香料植物在澳洲廣為種植［1-2］。20世紀(jì)90年代初，由于認(rèn)識(shí)到互葉白千層的重要價(jià)值，我國開始規(guī)模引種互葉白千層［3］。

廣西林科院1998 年引進(jìn)了白千層優(yōu)良種子并進(jìn)行引種試驗(yàn)，后續(xù)研發(fā)了白千層組培無性繁殖技術(shù)［4-5］，并針對白千層栽培種過程中的水份［6-8］、養(yǎng)分需求［9-12］以及采收方式等進(jìn)行了全面的研究，為白千層的規(guī)范化推廣種植提供了充分的技術(shù)指導(dǎo)。對從澳大利亞引進(jìn)的白千層芳香油樹種天然種子進(jìn)行繁育，并對生長期為18 個(gè)月的白千層枝葉進(jìn)行含油量測定，分析不同種源、家系白千層芳香油組分及含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)互葉白千層天然家系的單株各成分變異較大，同一家系不同植株的芳香油的主要成分含量差別也很大?；ト~白千層天然林種子可分為4-松油醇型，1，8-桉葉素型和中間型3種類型［13-15］。其中前兩種類型更具開發(fā)價(jià)值。4-松油醇型白千層選優(yōu)工作已有福建、廣西、廣東等地開展。福建林科院吳麗君等［16］以茶樹油國際標(biāo)準(zhǔn)（ISO4730-1996）為基準(zhǔn)，以枝葉量、含油率、精油中4-松油醇、1，8-桉葉素含量為評價(jià)指標(biāo)，復(fù)選出了14 株高精油優(yōu)良單株，1，8-桉葉素型研究較少。隨著白千層精油（茶樹油）的研究與應(yīng)用日趨活躍，對茶樹油的質(zhì)量要求也越來越高，根據(jù)需要選擇上述兩種化學(xué)型的互葉白千層優(yōu)株已迫在眉睫［17］。本研究擬以此為目標(biāo)，選擇出標(biāo)準(zhǔn)更高的優(yōu)株，以確保茶樹精油的品質(zhì)和產(chǎn)量，并通過組培技術(shù)實(shí)現(xiàn)“有性起源，無性利用”，使互葉白千層種植加工項(xiàng)目經(jīng)濟(jì)效益最大化。

1 材料與方法

1.1 材料

廣西林科院948項(xiàng)目引種后在廣西區(qū)內(nèi)營造了多個(gè)實(shí)生苗林份，分布在玉林市玉州區(qū)仁東鎮(zhèn)、仁厚鎮(zhèn)，以及欽州市欽州林科所。實(shí)生林份種植樹齡4 年，株行距0.8 m×0.8 m，種植面積7 hm2，種植地土壤為薄層黃紅壤，肥力較低，周邊為桉樹林。種植后每年追肥2 次，分別在4～5 月和7～8 月實(shí)施。追肥時(shí)在每株樹冠滴水線一側(cè)偏上（距離幼樹樹根20 cm 以上）開深15 cm、長25 cm、底寬10 cm 施肥溝，施后立即蓋土，蓋土厚度要高出溝面，每株施復(fù)合肥（養(yǎng)分氮磷鉀總含量35%）100 g。每年采用割灌撫育或除草劑除草2次。

1.2 方法

1.2.1 優(yōu)樹選擇方法

1.2.1.1 初選

通過目測，在白千層林中選取樹冠較大，枝葉濃密的單株。采集目測所選單株的葉子，用手揉搓后聞其味道，4-松油醇香味濃郁并且無桉葉素的特殊涼味植株作為4-松油醇型初選優(yōu)株，桉葉素的特殊涼味濃郁的植株作為1，8-桉葉素型初選優(yōu)株，分別做好標(biāo)記。

1.2.1.2 復(fù)選

采集標(biāo)記植株的枝葉（去除大于1 cm 的枝條及枯黃枝葉），用塑料袋包裝好，當(dāng)天運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，稱重，測定其含油率和精油成分。精油提取采用水蒸汽蒸餾法，主要成分的含量檢測參照國際標(biāo)準(zhǔn)ISO4730 執(zhí)行。精油中4-松油醇大于38%、1，8-桉葉素小于3%、含油率大于1.0%的植株，確定為4-松油醇型復(fù)選優(yōu)株。精油中1，8-桉葉素含量大于60%、枝葉含油率大于1.5%的植株，確定為1，8-桉葉素型復(fù)選優(yōu)株。

1.2.1.3 決選

對復(fù)選株進(jìn)行平茬處理，并進(jìn)行撫育。待其萌芽后，取萌芽條，ABT 處理后進(jìn)行扦插育苗。將成活的扦插苗進(jìn)行大田種植，株行距0.8 m×0.8 m，測定1 年生植株的樹高、地徑、枝葉生物量（去除大于1 cm 的枝條及枯黃枝葉），并再次測定枝葉的含油率和精油成分，測定方法同1.2.1.2。單株得油量大于10 g的即決選為優(yōu)株。

1.2.1.4 主要評價(jià)指標(biāo)增益估算

以復(fù)選優(yōu)株1年生植株的枝葉生物量（去除大于1 cm 的枝條及枯黃枝葉）、含油率、得油量平均值為參照，計(jì)算決選優(yōu)株枝葉生物量、含油率及得油量的增益。

1.2.2 不同生化類型互葉白千層種質(zhì)資源分子鑒別

1.2.2.1 DNA提取

選取4-松油醇型和1，8-桉葉素型植株共28份，采集試樣幼嫩葉片，采集當(dāng)天或第2 天進(jìn)行DNA 提取。采用改良CTAB 法提取互葉白千層總DNA。取5 μL DNA，分別利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測所提取DNA純度與濃度。

1.2.2.2 SSR 反應(yīng)體系與程序

SSR-PCR 反應(yīng)體系經(jīng)過比較和優(yōu)化確定為10 μL，包括Buffer（1×）、dNTPs（200 μmol/L）、Forward primer （0.5 mmol/L）、Reverse Primer（0.5 mmol/L）、模板DNA（5 ng）、Taq 酶（1U）、Mg2+（1.0 mmol/L、1.5 mmol/L、2.0 mmol/L）。其中Mg2+的濃度根據(jù)引物信息確定。

SSR 優(yōu)化程序：94℃預(yù)變性4 min，20 個(gè)循環(huán)（94℃變性30 s，66～56℃梯度降溫?cái)U(kuò)增30 s，每循環(huán)降0.5℃，72℃延伸1 min），26 個(gè) 循環(huán)（94℃變性30 s，56℃復(fù)性30 s，72℃延伸1 min），72℃延伸10 min，4℃保存。

1.2.3 試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

SSR 擴(kuò)增產(chǎn)物所得的電泳圖譜中的每個(gè)譜帶均視為1 個(gè)引物的結(jié)位點(diǎn)。統(tǒng)計(jì)譜帶時(shí)認(rèn)為電泳遷移率相同的譜帶是擴(kuò)增基因組上的相同DNA片段的產(chǎn)物。選用清晰、重復(fù)性好的譜帶進(jìn)行分析，采用人工讀帶法，按譜帶的有或無分別賦值，擴(kuò)增譜帶有時(shí)記為“l(fā)”，無時(shí)記為“0”，得到原始的“0/l”矩陣。并建立引物SSR識(shí)別卡。

遺傳多樣性分析主要計(jì)算多態(tài)位點(diǎn)百分率并利用物種遺傳分析軟件POPGEN 對統(tǒng)計(jì)的“0/1”數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行分析，計(jì)算等位基因平均數(shù)N1、有效等位基因數(shù)N2、基因多樣性指數(shù)Hs、遺傳距離、遺傳一致度。

2 結(jié)果與分析

2.1 4-松油醇型互葉白千層優(yōu)良單株選擇

經(jīng)過篩選獲得初選優(yōu)株103株，復(fù)選后獲得復(fù)選優(yōu)株34 株，再經(jīng)生物量測定決選優(yōu)株7 株。初選備選株103株，白千層單株得油率和成分差異較大，得油率在0.88%～2.2%，精油中4-松油醇含量在33.63%～42.70%，1，8-桉葉素含量在0.44%～9.55%。復(fù)選優(yōu)株的得油率及成分含量見表1。

復(fù)選的34 株優(yōu)株，含油率＞1.0%（1.07%～1.83%），精油中1，8-桉葉素含量＜3.0%（0.44%～2.94%）， 4- 松 油 醇 含 量＞38.0% （38.72%～42.70%）。決選的優(yōu)株7 株，其單株得油量均大于10 g（11.30～26.58 g），含油率為1.00%～1.46%，精油中4-松油醇含量為38.04%～40.27%，1，8-桉葉素含量為1.09%～2.21%。見表2。

2.2 1，8-桉葉素型互葉白千層優(yōu)良單株選擇

初選獲得備選株78 株，復(fù)選確定復(fù)選優(yōu)株22株，復(fù)選優(yōu)株的得油率及成分含量見表3。

復(fù)選的22 株優(yōu)株，含油率＞1.5%（1.521%～3.329%），精油的特征組分為1，8-桉葉素含量＞60% （63.04%～69.61%），4-松 油醇含量＞1.0%（1.051%～2.528%），α-蒎烯：1%～5%，苧 烯：5%～10%，α-松油醇：6%～15%（表4）。

2.3 互葉白千層SSR引物篩選

經(jīng)過SSR-體系優(yōu)化及引物篩選，從SSR 選擇性擴(kuò)增引物組合中篩選出適合互葉白千層的4組擴(kuò)增條帶明晰的引物組合，4組引物組合分別為Em‐bra53、Embra77、Embra203、eSSR0952。引物 見表5。

通過人工讀帶法，對SSR 擴(kuò)增產(chǎn)物所得清晰、重復(fù)性好的電泳圖譜建立“0/1”數(shù)據(jù)矩陣。利用物種遺傳分析軟件POPGEN 對統(tǒng)計(jì)的“0/1”數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行分析，白千層遺傳多樣性分析，4 對SSR引物共擴(kuò)增出68 條譜帶，其中多態(tài)性譜帶64 條，多態(tài)率為94.12%。遺傳一致度為0.303 5～0.897 1；遺傳距離為1.007 5～9.412 8，表明白千層28份材料遺傳基礎(chǔ)廣泛，多態(tài)性豐富。SSR 的部分?jǐn)U增圖譜如圖1所示。

結(jié)合精油成分與遺傳距離綜合分析，在進(jìn)一步聚類分析中，28 份材料被劃分為2 大類，其中16 份（包括14 個(gè)桉葉素型、2 個(gè)4-松油醇型）為一類，12 份（包括3 桉葉素型、9 個(gè)4-松油醇型）為一類。除部分材料外，SSR 標(biāo)記將14 個(gè)桉葉素型與9個(gè)4-松油醇型區(qū)分開，可作為互葉白千層種質(zhì)資源鑒別的分子標(biāo)記。

表1 4-松油醇型互葉白千層復(fù)選優(yōu)株的得油率及其成分含量（%）

表2 決選的4-松油醇型優(yōu)良單株指標(biāo)

表3 1，8-桉葉素型互葉白千層復(fù)選優(yōu)株的得油率及其成分含量（%）

表4 實(shí)測1，8-桉葉素型選擇白千層單株精油成分含量（%）

3 討論與結(jié)論

優(yōu)良單株選擇的理論基礎(chǔ)是種內(nèi)個(gè)體間普遍存在著變異。相關(guān)研究表明，互葉白千層種源間、種源內(nèi)、家系間、家系內(nèi)的單株個(gè)體間茶樹油的產(chǎn)量和質(zhì)量均存在較大差異。因此，在實(shí)生苗優(yōu)良群體中進(jìn)行優(yōu)良單株的篩選是可行的。

初選通過目測和鼻嗅的方法，對生物量和精油成分進(jìn)行初步篩選，確定備選株，可以減少后續(xù)篩選工作的工作量。復(fù)選以含油率、精油中4-松油醇、1，8-桉葉素含量做為選擇指標(biāo)，其中4-松油醇型優(yōu)良單株要求含油率＞1.0%，精油中4-松油醇含量＞38%，1，8-桉葉素含量＜3%，這些指標(biāo)高于最新的茶樹油國際標(biāo)準(zhǔn)［ISO4730：2017（E）］，也高于吳麗君等［16］的選優(yōu)標(biāo)準(zhǔn)（其入選14 株復(fù)選株中有12 株精油中1，8-桉葉素含量高于3%），同時(shí)高于梁忠云等［17］的選優(yōu)標(biāo)準(zhǔn)（其精油中4-松油醇含量35%～40%，1，8-桉葉素含量為3.99%）。

表5 引物及引物序列

1，8-桉葉素型互葉白千層優(yōu)株選擇時(shí)，復(fù)選以含油率、精油中1，8-桉葉素含量做為選擇指標(biāo)，要求含油率＞1.5%，精油中1，8-桉葉素含量＞60%，這些選擇指標(biāo)是基于廣西地方標(biāo)準(zhǔn)《互葉白千層（精） 油，1，8-桉葉素型》（DB 45/T 889-2012）和實(shí)際測定。與DB 45/T 889-2012 制定的標(biāo)準(zhǔn)各成分相比，本標(biāo)準(zhǔn)選育的植株經(jīng)過加工的精油成分含量范圍還是差異較大，本研究選擇的單株加工后的精油更適合工業(yè)應(yīng)用。

決選的優(yōu)株是在復(fù)選優(yōu)株的基礎(chǔ)上對生物量、得油量進(jìn)行篩選后得到的，得油量做為終極的判定指標(biāo)。決選優(yōu)株和復(fù)選優(yōu)株相比，枝葉生物量、得油量均有較大增益，分別為29.5%～110.8% 和46.6%～237.9%。經(jīng)過決選后的優(yōu)良單株的精油產(chǎn)量和質(zhì)量都優(yōu)于國內(nèi)的優(yōu)良單株。

無性系選優(yōu)是良種選育的重要方法之一，經(jīng)無性系選優(yōu)并測定的優(yōu)株，可通過無性繁殖實(shí)現(xiàn)規(guī)模利用。本研究中編號34、113的無性系是組培快繁的主要目標(biāo)植株，同時(shí)擬引進(jìn)福建H38等優(yōu)良無性系推廣種植，以增加無性系數(shù)量，豐富白千層人工林遺傳多樣性。

本研究利用4對SSR引物對28份實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行了初步擴(kuò)增分析，共擴(kuò)增出68 條譜帶，其中多態(tài)性譜帶64 條，多態(tài)率為94.12%。遺傳一致度為0.303 5～0.897 1；遺傳距離為1.007 5～9.412 8，表明28 份材料遺傳基礎(chǔ)廣泛，多態(tài)性豐富。其中SSR 標(biāo)記將14 個(gè)桉葉素型與9 個(gè)4-松油醇型區(qū)分開，本研究結(jié)果為互葉白千層種質(zhì)資源分子鑒別奠定了研究基礎(chǔ)。