1株鴨3型腺病毒的分離鑒定及fiber基因序列分析

嚴專強 曾凡桂 招麗嬋 王占新 魯俊鵬*

1.溫氏食品集團股份有限公司，廣東新興527400；2.廣東省畜禽健康養(yǎng)殖與環(huán)境控制企業(yè)重點實驗室，廣東新興527400

腺病毒（Adenovirus，ADV）為線狀雙股DNA 病毒，無囊膜，直徑70～110 nm，呈二十面體對稱。腺病毒粒子由252 個殼粒組成，包含240 個不在頂點的殼粒（六鄰體）和12 個頂點殼粒（五鄰體）。每個五鄰體基底帶有1～2 根被稱為纖絲的纖突（fiber），纖絲的長度與病毒的抗原性相關(guān)。感染禽類的腺病毒主要有3 個群，I 群代表株是雞胚致死性孤兒病毒，目前從雞分離到12 個血清型，火雞2 個血清型，鵝4 個血清型，鴨2 個血清型；Ⅱ群主要包括火雞出血性腸炎病毒、大理石脾病毒和雞大脾病病毒；Ⅲ群與減蛋綜合征相關(guān)，目前只包含一個成員，即減蛋綜合征病毒[1-2]。

鴨l 型腺病毒是與減蛋綜合癥相關(guān)的Ⅲ群腺病毒，鴨2 型腺病毒于1977年從法國番鴨中分離，該病毒抗原與已知的腺病毒不同，是一種新型的禽腺病毒[3]。2014年奧地利科學家Marek 等通過高通量測序技術(shù)獲得該病毒全序列，該型病毒被正式命名[4]。鴨3 型腺病毒于2014年在我國首次分離，該病毒hexon基因推導(dǎo)的氨基酸序列與鴨2 型腺病毒GR 株同源性僅為60%，且該病毒含有2 個fiber 基因（fiber-1 和fiber-2），而GR 株只含有1 個[5]。為了解鴨3 型腺病毒的流行與變異情況，本研究對近期廣東地區(qū)分離的毒株進行了主要免疫原性相關(guān)基因序列測定和分析，以期為該病的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑

13日胚齡番鴨胚由溫氏食品集團股份有限公司提供；ExTaq 酶、DL 2000 DNA Marker、Prime－Script One Step RT-PCR Kit、pMD-19 T 載體等購自TaKaRa 公司；DNA 提取試劑盒（Stool DNA Kit）購自O(shè)MEGA 公司；小牛血清為GIBCO 公司產(chǎn)品，無菌分裝后20 ℃保存?zhèn)溆?；DMEM 培養(yǎng)液及胰酶等購自GIBCO 公司。

1.2 臨床樣品處理

2019年10月，廣東某鴨場30日齡番鴨出現(xiàn)肝臟腫大、出血、白色點狀壞死等癥狀。采集發(fā)病鴨肝臟置于玻璃研磨器中充分研磨，收集組織懸液于2 mL 離心管中，反復(fù)凍融3 次，離心棄沉淀，取上清液通過0.22 μm 濾膜過濾，所得樣本置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 病毒分離

番鴨胚成纖維細胞按常規(guī)方法制備，將待分離樣本接種番鴨胚成纖維細胞，每天觀察，72 h 后將細胞凍融3 次再次接種番鴨胚成纖維細胞傳代，盲傳至第5 代，收獲細胞標記為GD2019。

1.4 PCR 鑒定

參照文獻[6-7]分別合成針對鴨3 型腺病毒（DAdV-3）、鴨肝炎病毒（DHV）、呼腸孤病毒（MDRV）、小鵝病毒（GPV）的引物對細胞分離到的病毒進行PCR 檢測，各反應(yīng)溫度見表1。擴增產(chǎn)物用1 g/L 瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用凝膠成像系統(tǒng)照像。

1.5 fiber 基因測序與分析

用fiber 基因測序引物（表1）對鑒定為鴨3 型腺病毒的細胞培養(yǎng)物進行擴增，將PCR 產(chǎn)物回收純化后連接于pMD-19 T 載體，轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α感受態(tài)細胞，挑取單克隆菌落，37 ℃過夜搖菌，菌液PCR 鑒定為陽性的樣品送華大基因測序公司進行測序。序列使用DNASTAR 和MEGA 7.0 軟件進行拼接和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒分離結(jié)果

用特異性引物對分離株進行DHV、MDRV 和GPV 的PCR 檢測，均未檢測到陽性，而用DAdV 特異性引物檢測到了陽性病毒（圖1）。

2.2 fiber 基因同源性分析

測序結(jié)果顯示，GD2019 株fiber-1 基因全長為1 380 bp，編碼459 個氨基酸，fiber-2 基因全長為1 443 bp，編碼480 個氨基酸。氨基酸序列同源性分析發(fā)現(xiàn)，GD2019 株與已報道的鴨3 型腺病毒的fiber-1 和fiber-2 同源性均為100%（表2）。GD2019株fiber-1 與鴨1 型腺病毒、鴨2 型腺病毒、鵝4 型腺病毒和雞4 型腺病毒同源性在12.2%～25.8%之間，GD2019 株fiber-2 與鵝4 型腺病毒和雞4 型腺病毒同源性分別為37.1%和23.7%（表2）。結(jié)果表明，鴨3 型腺病毒的fiber 基因非常保守，與其他禽腺病毒同源性較低。

圖1 病毒分離毒株P(guān)CR 檢測結(jié)果

2.3 fiber 基因進化分析

分別對GD2019 株fiber-1 和fiber-2 基因序列與GenBank 上已發(fā)表的不同種屬禽腺病毒的fiber基因進行分子進化分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鴨3 型腺病毒fiber-1 基因聚類在1 個分支，與鴨2 型腺病毒、鴨1型腺病毒以及其他禽腺病毒處于不同分支（圖2）。鴨3 型腺病毒fiber-2 基因與鵝4 型腺病毒親緣關(guān)系較近，與其他禽腺病毒親緣關(guān)系較遠。

表1 病毒檢測引物

表2 分離株與其他禽腺病毒fiber基因核苷酸序列推導(dǎo)的氨基酸序列同源性比較

圖2 分離株fiber 基因推導(dǎo)的氨基酸序列遺傳進化樹

3 討論

fiber 基因在腺病毒的感染過程中起著關(guān)鍵作用，所有感染力強的禽腺病毒都被檢測到含有2 個fiber 基因[8]。缺失fiber-1 后會造成病毒產(chǎn)量下降，腺病毒受體的特異性轉(zhuǎn)導(dǎo)作用下降，使病毒只能感染禽類細胞，不能感染哺乳動物類細胞；缺失fiber-2 會導(dǎo)致病毒無法增殖、組裝或擴散，不能產(chǎn)生病毒粒子[9]。本研究從臨床發(fā)病鴨肝臟中成功分離了1株鴨3 型腺病毒，序列分析發(fā)現(xiàn)該型病毒fiber 基因非常保守，且比鴨1 型和鴨2 型腺病毒多1 個基因片段。推測鴨3 型腺病毒感染力比鴨1 型和鴨2 型腺病毒強，這可能是2014年以來該病毒在廣東和福建等地區(qū)鴨群中持續(xù)流行的原因。

鴨3 型腺病毒的fiber-2 蛋白具有良好的免疫原性。Yin 等[7]在大腸桿菌中表達并純化了鴨3 型腺病毒的fiber-1 和fiber-2 蛋白，免疫攻毒保護試驗結(jié)果顯示，重組fiber-2 蛋白免疫組IgY 抗體水平顯著高于fiber-1 組和全病毒滅活疫苗組，重組fiber-2 蛋白免疫可以提供100%的攻毒保護，并完全抑制排毒，優(yōu)于fiber-1 蛋白和全病毒滅活疫苗。疫苗免疫是針對鴨3 型腺病病毒有效的防控方法，高效疫苗的研發(fā)對該病的控制具有重要意義。