雞蛋和胎糞禽白血病病毒p27抗原檢測試驗

童洪生

福建省建寧縣動物疫病預(yù)防控制中心，福建建寧354500

禽白血?。ˋL）是一種免疫抑制性疾病，禽白血病病毒（ALV）可以通過垂直和水平2 種方式傳播感染雞群，給養(yǎng)雞業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。迄今為止，尚無有效預(yù)防和治療措施，對雞群的凈化是控制AL 的唯一有效途徑[1-2]。開展AL 的凈化，主要是通過對種雞群進行ALV 檢測，淘汰帶毒的種雞，經(jīng)過不斷地檢測和淘汰，達到純化種群的目的[3]。為明晰雞蛋和胎糞ALV p27 抗原的變化規(guī)律，選擇某雞場2 個品系的雞群，分別對雞蛋和雛雞胎糞開展p27 抗原檢測試驗。

1 材料與方法

1.1 材料

1）種雞與雞蛋。選擇某品種雞的2 個品系為試驗群體，分別為快羽系和慢羽系。43 周齡種雞純繁前，對1 492 只母雞，連續(xù)9 d 采集雞蛋，每3 d 撿1 次。超過3 枚雞蛋的保留3 枚，不到3 枚雞蛋的母雞以實際采集雞蛋數(shù)為準，共采集種蛋4 316 枚。不同品系采集種蛋數(shù)見表1。

表1 不同品系種蛋采樣統(tǒng)計

公雞使用泄殖腔棉拭子，開展p27 抗原檢測，其中快羽系檢測公雞153 只，慢羽系共檢測公雞148 只。

2）雛雞與胎糞。保留p27 抗原檢測為陰性的公雞和母雞，按公母1∶5[3]組建家系。每3～4 d 人工輸精1 次，每15 d 入孵1 批種蛋。根據(jù)生產(chǎn)的安排，快羽系入孵1 批，慢羽系入孵3 批。孵化條件為37.5 ℃，濕度65%[4]。種蛋落盤時按家系分組，每1個全同胞家系的種蛋放在1 個出雛筐內(nèi)。雛雞出生時佩戴翅號，登記家系編號。每戴完1 個家系的翅號，立即用消毒液洗手，不同批次入孵的種蛋和雛雞數(shù)見表2。

表2 不同批次不同品系檢測雛雞數(shù) 只

3）試劑。①禽白血病病毒p27 抗原ELISA 檢測試劑盒：IDEXX 公司。②酒精棉：75%酒精浸泡。

4）主要儀器。酶標儀（Thermo）、洗板機（Biorad、Thermo）、100 μL 單道移液器（Eppendorf）、300 μL八道移液器（Eppendorf）等。

1.2 方法

1）蛋清的采集與處理。酒精棉擦拭蛋殼表面后用鑷子輕輕將蛋殼敲破，用移液器在蛋殼破碎處吸取蛋清1 mL，轉(zhuǎn)入到1.5 mL 離心管內(nèi)，凍融2～3次[5]用于下一步試驗。

2）泄殖腔棉拭子的采樣與處理。用酒精棉擦拭公雞肛門外側(cè)，棉簽伸入公雞肛門內(nèi)2 cm 處[6]，旋轉(zhuǎn)1 周后取出，放入預(yù)先加入0.5 mL 稀釋液離心管內(nèi)，靜置2 h，取出棉簽。樣品凍融1 次后可用于下一步試驗。

3）胎糞的采集與處理。用1.5 mL 離心管，提前加入0.5 mL 稀釋液。雛雞出生12 h 內(nèi)用手抓住雛雞，輕壓雛雞腹部，將胎糞擠入離心管內(nèi)，來回顛倒搖勻。為了快速凍融胎糞樣品以釋放p27 抗原，將樣品迅速放入液氮中快速冷凍，5 min 后取出，室溫內(nèi)溶解回溫，靜置1 h 準備下一步試驗[7]。

4）ELISA 檢測。按照IDEXX 禽白血病病毒p27抗原ELISA 檢測試劑盒說明書進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 種蛋p27 抗原檢測結(jié)果

1）不同品系比較。本試驗檢測了快羽系760 只雞，共2 202 枚雞蛋，有43 只雞檢測到陽性雞蛋，陽性比例為5.7%，其中6 只雞3 枚雞蛋都為陽性，4只雞2 枚雞蛋顯示陽性，33 只雞有1 枚雞蛋檢測結(jié)果為陽性。本試驗檢測了慢羽系732 只雞，共2 114枚雞蛋，有47 只雞檢測到陽性雞蛋，陽性比例為6.4%，其中7 只雞3 枚雞蛋為陽性，10 只雞2 枚雞蛋為陽性，30 只雞有1 枚雞蛋為陽性。按照疾病凈化標準，只要有1 枚雞蛋p27 抗原結(jié)果檢測為陽性，則認為該雞為ALV 攜帶者，判為陽性雞。檢測結(jié)果顯示慢羽系陽性比例略高于快羽系。

2）不同重復(fù)雞蛋數(shù)比較。表3 給出了不同重復(fù)雞蛋數(shù)p27 抗原檢測結(jié)果。當重復(fù)雞蛋數(shù)為3 枚時，在1 372 只母雞中有13 只雞的3 枚蛋為陽性，12 只雞的2 枚蛋為陽性，58 只雞的1 枚蛋檢測結(jié)果為陽性。檢測雞蛋數(shù)為3 枚時，1 372 只雞有83只為陽性雞，比例6.0%。當檢測雞蛋數(shù)為2 枚時，80只雞有4 只為陽性雞，比例5.0%。當檢測雞蛋數(shù)為1 枚時，40 只雞僅1 只雞檢測到陽性雞蛋，陽性比例2.5%。

以上結(jié)果證明，即使檢測3 枚重復(fù)雞蛋，并不一定3 枚蛋都為陽性，更大比例（69.9%）是僅檢測到1 枚陽性雞蛋。隨著檢測重復(fù)雞蛋數(shù)的增加，檢出陽性雞的比例數(shù)也相應(yīng)增加。

2.2 雛雞胎糞p27 抗原檢測結(jié)果

1）快羽系。結(jié)合實際生產(chǎn)的安排，本試驗快羽系僅繁育1 批，共檢測了275 個全同胞家系，2 560份雛雞胎糞樣品。如果按照個體統(tǒng)計，2 560 份檢測樣品中共檢測到37 個陽性個體，陽性比例僅1.45%。而如果按照家系統(tǒng)計（表4），則30 個家系，也就是仍然有30 只母雞的后代出現(xiàn)了陽性雞，比例達10.9%。

2）慢羽系。本試驗慢羽系共繁育3 批，3 個批次檢測的家系數(shù)有所不同，分別檢測了224、241 和194 個家系的后代雛雞。如果按照個體統(tǒng)計（表5），第1 批檢測雛雞2 142 只，陽性個體104 只，陽性比例4.9%；第2 批檢測雛雞2 227 只，陽性個體125 只，陽性比例5.6%；第3 批檢測雛雞1 454 只，陽性雞78 只，陽性比例為5.4%。3 個批次的平均陽性率為5.3%。

表3 不同重復(fù)雞蛋數(shù)檢測結(jié)果

表4 快羽系按家系統(tǒng)計檢測結(jié)果

表5 慢羽系不同批次按個體統(tǒng)計陽性比例

按照家系統(tǒng)計（表6），3 批繁育中，第1 批的224 個家系中有72 個檢出陽性雛雞，陽性家系比例32.1%；第2 批的241 個家系中有83 個檢出了陽性雛雞，陽性家系比例34.4%；第3 批的194 個家系中有56 個檢出了陽性雛雞，陽性家系比例28.9%。3次平均陽性家系比例為32.0%。出現(xiàn)1 個陽性的家系占全部陽性家系的67.3%，出現(xiàn)2 個陽性的家系占24.6%；少數(shù)家系會出現(xiàn)3 個或4 個，甚至5 個陽性雛雞。

由慢羽系同一個家系在不同批次之間的比較結(jié)果可以看出（表7）：3 批純繁都有雛雞的家系有173 個，其中13 個家系在3 批中都檢出了陽性雛雞，占7.5%；有37 個家系在2 批中檢出了陽性雛雞，占21.4%；68 個家系只在1 批中檢出了陽性雛雞，比例39.3%，另外55 個家系（31.8%）在3 批純繁檢測中都未檢出陽性雛雞。僅2 批純繁有雛雞后代的家系有64 個，4 個家系2 次都檢出了陽性雛雞，18 個家系僅1 次檢出陽性雛雞。檢出陽性雛雞家系比例合計34.4%，低于3 次都有雛雞家系中檢出陽性雛雞家系的比例（68.2%）。僅1 批純繁有雛雞的家系有45 個，陽性家系比例17.8%，檢出率遠低于2 批有雛雞和3 批都有雛雞的情況。

本試驗還對同一批同一家系檢出陽性雛雞只數(shù)以及重復(fù)性進行了比較（表8）。如果在某一批次雛雞中檢出陽性雞只數(shù)≥3 只的家系，則93.4%的家系在2 批或者3 批純繁中都會檢出陽性雛雞。而如果某一批次中檢出2 只陽性雛雞的家系，則45%的家系會在2 批或3 批純繁中都檢出陽性雛雞。如果檢出陽性雞只數(shù)只有1 只的家系，則僅有23.7%的家系會2 次及以上檢出陽性雛雞。

表6 慢羽系不同批次按家系統(tǒng)計陽性比例

表7 慢羽系同一家系不同批次間比較

表8 同一批中檢出陽性雞只數(shù)與重復(fù)性的比較

3 討論

ALV 可以通過垂直和水平2 種方式傳播感染雞群，而且是一種免疫抑制性疾病，對養(yǎng)雞業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失[8-10]。迄今為止，尚無有效預(yù)防和治療措施，因此，對雞群的凈化是控制AL 的唯一有效途徑。主要是通過對種雞群進行ALV 檢測，淘汰帶毒的種雞，通過不斷的凈化達到純化種群的目的[8]。

本試驗為明晰雞蛋和胎糞ALV p27 抗原的變化規(guī)律，選擇了某雞場2 個品系的雞群，分別對雞蛋和雛雞胎糞開展了p27 抗原檢測試驗，共檢測了2 個品系1 492 只母雞的4 316 枚種蛋和8 383 只雛雞胎糞。得出如下結(jié)論：

1）雞蛋和胎糞檢測結(jié)果顯示，慢羽系A(chǔ)L 感染陽性率均高于快羽系。

2）ALV 感染雞只排毒呈間歇性，檢測重復(fù)數(shù)越多，檢出的陽性率越高，檢測的準確性和可靠性越高。為了提高檢測效率，對種蛋需盡可能采集2～3個樣品，雛雞出生時需要全部檢測，以加快凈化速度[9]。

3）純繁之前對種蛋進行ALV 檢測，陰性雞留種純繁，并不能保證雛雞出生時全部為陰性，群體仍然存在低比例的陽性雛雞。為有效凈化AL，需多次重復(fù)檢測，及時淘汰陽性雛雞及其父母代，在控制ALV 垂直傳播的同時，也盡量減少其水平傳播機率，逐步完成AL 的凈化[10-11]。