新疆巴州地區(qū)奶牛隱性乳房炎金黃色葡萄球菌的分離鑒定與耐藥性分析

馬 博 卜三平 周鴻淼 王艷萍 劉 鴿

1.巴音郭楞職業(yè)技術(shù)學(xué)院，新疆庫(kù)爾勒841000；2.新疆維吾爾自治區(qū)畜牧總站，烏魯木齊830000

奶牛乳房炎（mastitis）也稱(chēng)乳腺炎，是泌乳牛乳腺細(xì)胞受到化學(xué)、物理和致病微生物等多種因素影響而產(chǎn)生的一種炎癥反應(yīng)，是奶牛場(chǎng)中常見(jiàn)的疾病之一，嚴(yán)重影響奶牛場(chǎng)的經(jīng)濟(jì)效益。根據(jù)有無(wú)臨床癥狀和患病的嚴(yán)重程度，分為臨床型乳房炎和隱性乳房炎，臨床型乳房炎常伴有紅、腫、熱、痛癥狀。引起奶牛乳房炎的細(xì)菌種類(lèi)眾多，約150 種[1-5]，3 種最為常見(jiàn)的致奶牛乳房炎致病菌為大腸桿菌、鏈球菌和金黃色葡萄球菌。研究[6-10]證明，金黃色葡萄球菌的危害最大，金黃色葡萄球菌可產(chǎn)生致熱性外毒素、殺白細(xì)胞素、腸毒素、剝脫毒素、溶血毒素和中毒性休克綜合癥毒素等，容易引起奶牛乳腺組織不可修復(fù)的損傷；導(dǎo)致金黃色葡萄球菌引起的乳房炎治愈率低的另一個(gè)重要因素是金黃色葡萄球菌易對(duì)抗生素產(chǎn)生耐藥性[11-13]。分子生物學(xué)在21世紀(jì)的生命科學(xué)領(lǐng)域占有重要位置，其中的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）檢測(cè)技術(shù)是一種在體外擴(kuò)增目的DNA 片段的技術(shù)，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、快速簡(jiǎn)便（2 d左右）、取材方便等諸多優(yōu)點(diǎn)，在細(xì)菌檢測(cè)中應(yīng)用廣泛[14]。本文主要針對(duì)新疆巴州地區(qū)庫(kù)爾勒市、輪臺(tái)縣、尉犁縣、若羌縣、且末縣、焉耆縣、和靜縣、和碩縣、博湖縣共八縣一市規(guī)?；膛?chǎng)奶牛隱性乳房炎做抽樣調(diào)查，從患隱性乳房炎奶牛的乳汁中分離鑒定金黃色葡萄球菌，分別從金黃色葡萄球菌的形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)、分子水平等方面鑒定巴州八縣一市規(guī)模化養(yǎng)殖場(chǎng)的奶牛隱性乳房炎的金黃色葡萄球菌的陽(yáng)性率，并進(jìn)行了部分耐藥性分析，為控制奶牛隱性乳房炎的發(fā)病率和奶產(chǎn)量下降提供科學(xué)的理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1）樣品來(lái)源。分別從巴州地區(qū)庫(kù)爾勒市、輪臺(tái)縣、尉犁縣、若羌縣、且末縣、焉耆縣、和靜縣、和碩縣、博湖縣共八縣一市規(guī)模化奶牛場(chǎng)各抽檢200 頭泌乳奶牛的800 份乳樣，共計(jì)7 200 份乳樣（200 頭/區(qū)域×9 個(gè)區(qū)域×4 乳區(qū)/頭=7 200 個(gè)乳樣）。抽檢的奶牛全為澳系的荷斯坦泌乳奶牛。

2）主要儀器。超凈工作臺(tái)、恒溫箱（青島）、磁力加熱攪拌器（78-1 型）、PCR 儀（TC-512）、高速冷凍離心機(jī)（Multifuge X1R）、凝膠成像儀（Bio-Rad）、電泳槽（Power Wave XS2）、電泳儀（DYY-6B）、50 mL乳樣收集管、蒸餾水瓶、乳房炎診斷盤(pán)等。

3）主要試劑。蘭州隱性乳房炎診斷試劑（LMT）、蒸餾水、瓊脂糖、革蘭氏快速染色液、TaqDNA 聚合酶、DL-2000 DNA Marker（大連）、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（北京睿博興科生物）；普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、鮮血培養(yǎng)基、金黃色葡萄球菌選擇性培養(yǎng)基（也稱(chēng)高鹽甘露醇培養(yǎng)基）、甘露醇發(fā)酵試驗(yàn)生化鑒定培養(yǎng)基、麥芽糖培養(yǎng)基、葡萄糖培養(yǎng)基、蔗糖培養(yǎng)基、乳糖培養(yǎng)基、兔鮮血培養(yǎng)基[15-18]（配方中均按加100 mL 蒸餾水計(jì)算，如需要更多，可以根據(jù)倍數(shù)關(guān)系成倍增加配方中的其他物質(zhì)，但pH 不能改變）；丁胺卡那、卡那霉素、多西環(huán)素、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、克林霉素、青霉素、阿莫西林、頭孢氨芐、慶大霉素、鏈霉素、四環(huán)素12 種抗生素。

①金黃色葡萄球菌選擇性培養(yǎng)基：牛肉膏粉末0.2 g、蛋白胨2.0 g、D-甘露醇2.0 g、氯化鈉3.0 g、瓊脂粉末3.0 g、酚紅0.005 g，充分?jǐn)嚢钃u勻，調(diào)節(jié)pH至7.4，放121 ℃高壓滅菌20 min。

②LB 液體培養(yǎng)基：在錐形瓶中加酵母浸粉0.5 g、氯化鈉1.0 g、胰蛋白胨1.0 g、蒸餾水100 mL，將混合物搖勻，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH 在7.4～7.6 范圍內(nèi)。如混合物溶解不好，可用電熱套適當(dāng)加熱，121 ℃高壓滅菌20 min。

③LB 固體培養(yǎng)基：在錐形瓶中加酵母浸粉0.5 g、氯化鈉1.0 g、胰蛋白胨1.0 g、蒸餾水100 mL，將混合物搖勻，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH 在7.4～7.6 范圍內(nèi)，加入瓊脂粉1.8 g。將錐形瓶密封好后，放高壓鍋121 ℃高壓環(huán)境下滅菌20 min，可即時(shí)分裝試管（已經(jīng)高壓滅菌過(guò)），將試管立于斜面上，使培養(yǎng)基降溫后成斜面；也可放好備用，但需要將LB 固體培養(yǎng)基在電熱套上加熱，使之完全溶解，倒LB 固體培養(yǎng)基過(guò)程中要注意無(wú)菌操作。

④鄧亨氏水：稱(chēng)蛋白胨2.0 g、氯化鈉1.0 g，調(diào)節(jié)pH 至7.6，以備配制其他培養(yǎng)基使用。

⑤麥芽糖培養(yǎng)基：稱(chēng)麥芽糖2.0 g，用制備好的鄧亨氏水100 mL 使其溶解，加0.4 mL 1.6%溴甲酚紫（酒精）指示劑，然后試管分裝，115 ℃滅菌20 min。

⑥葡萄糖培養(yǎng)基：稱(chēng)葡萄糖粉1.0 g，用制備好的鄧亨氏水100 mL 使其溶解，加0.4 mL 1.6%溴甲酚紫（酒精）指示劑，然后試管分裝，115 ℃滅菌20 min。

⑦蔗糖培養(yǎng)基：稱(chēng)量蔗糖1.0 g，用制備好的鄧亨氏水100 mL 使其溶解，加0.4 mL 1.6%溴甲酚紫（酒精）指示劑，然后試管分裝，115 ℃滅菌20 min。

⑧乳糖培養(yǎng)基：稱(chēng)乳糖1.0 g，用制備好的鄧亨氏水100 mL 使其溶解，加0.4 mL 1.6%溴甲酚紫（酒精）指示劑，然后試管分裝，115 ℃滅菌20 min。

⑨兔鮮血培養(yǎng)基：采集兔血5～10 mL（常用心臟采血法，根據(jù)倒平板的多少來(lái)定），在注射器中提前抽取一定量的自配抗凝劑，采集血量要滿(mǎn)足抗凝劑的比例為5%，將兔鮮血和抗凝劑的混合物加入高壓滅菌好的LB 固體培養(yǎng)基中（溫度不宜太高，否則會(huì)使兔血變成暗紅色，溫度40～50 ℃為宜），搖勻，在已經(jīng)用紫外線(xiàn)消毒好的凈化工作臺(tái)內(nèi)倒入平板。

1.2 試驗(yàn)方法

1）隱性乳房炎的檢測(cè)及奶樣的采集。隨機(jī)從巴州地區(qū)的八縣一市規(guī)模化養(yǎng)殖場(chǎng)各抽檢200 頭奶牛，共1 800 頭奶牛的7 200 個(gè)乳區(qū)乳樣，使用LMT（圖1）進(jìn)行隱性乳房炎的檢測(cè)，以此確定八縣一市奶牛隱性乳房炎發(fā)病率。整體方案是采用現(xiàn)場(chǎng)采集乳樣、現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的方法，將被檢乳樣為陽(yáng)性的做好標(biāo)記。具體采集乳樣的方法為：使用干凈棉質(zhì)溫?zé)崦韺㈩A(yù)采樣的奶牛乳房和乳頭擦拭干凈，注意換洗毛巾，保持清洗桶內(nèi)水的干凈清澈，使用0.5%碘伏溶液對(duì)乳頭藥浴1 min 左右，使用75%的酒精噴灑整個(gè)乳房，將碘伏溶液沖洗干凈，使用衛(wèi)生紙將乳房和乳頭擦拭干凈，擠掉前3 把奶后，將50 mL 乳樣收集管置于奶牛乳房下并收集滿(mǎn)待檢乳樣，擠奶過(guò)程防止污染收集管；將待檢乳樣20 mL 左右倒入檢測(cè)盤(pán)的檢測(cè)杯內(nèi)，將檢測(cè)盤(pán)傾斜，棄去多余乳汁，使檢測(cè)杯內(nèi)留下約2 mL 乳樣，再將稀釋好的LMT 2 mL 擠入每個(gè)檢測(cè)杯中，水平同心圓搖動(dòng)35 s，使乳樣與LMT 充分混合，根據(jù)混合物的沉淀情況確定待檢乳樣的乳房炎陰陽(yáng)性，見(jiàn)圖2。取待檢乳樣LMT 陽(yáng)性的乳樣2 mL 于高壓處理的EP管內(nèi)，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2）金黃色葡萄球菌的分離、純化培養(yǎng)。分別蘸取LMT 陽(yáng)性的乳樣到普通營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，置37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h。在金黃色葡萄球菌選擇性平板培養(yǎng)基上劃線(xiàn)接種培養(yǎng)，置37 ℃恒溫箱中18～24 h[19]。金黃色葡萄球菌選擇性培養(yǎng)基上菌落生長(zhǎng)良好時(shí)，在經(jīng)紫外線(xiàn)照射消毒好的超凈工作臺(tái)中使用接種環(huán)挑取單個(gè)典型菌落，在兔鮮血培養(yǎng)基上劃線(xiàn)培養(yǎng)，37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)18～24 h。革蘭氏染色，鏡檢，觀(guān)察菌體的染色特性和形態(tài)。將鏡檢為金黃色葡萄球菌的菌落接種到金黃色葡萄球菌液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，起到增殖的目的。

圖1 蘭州隱性乳房炎診斷試劑（LMT）

圖2 在檢測(cè)盤(pán)中使用（LMT）檢測(cè)乳樣

3）金黃色葡萄球菌的生化鑒定。對(duì)培養(yǎng)的待檢細(xì)菌分離、純化、培養(yǎng)后，進(jìn)行生化鑒定：血漿凝固酶試驗(yàn)、過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)、蔗糖發(fā)酵試驗(yàn)、麥芽糖發(fā)酵試驗(yàn)、乳糖發(fā)酵試驗(yàn)、甘露醇發(fā)酵試驗(yàn)，對(duì)照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》，觀(guān)察試驗(yàn)結(jié)果[20-24]。

4）金黃色葡萄球菌的16S rRNA 鑒定。參考16S rRNA 基因測(cè)序法，完成16SrDNAPCR擴(kuò)增。上游引物為：5’-CGAAAGCCTGACGGAGCAAC-3’；下游引物為：5’-AACCTTGCGGTCGTACTCCC-3’（六合華大基因科技合成）。參照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒操作步驟提取金黃色葡萄球菌菌株的基因組DNA。以基因組DNA 為模板擴(kuò)增16S rRNA基因，PCR 法采用20 μL 反應(yīng)體系：ddH2O 8 μL，PCR Mix 8 μL，模板2 μL，上、下游引物均1.0 μL；反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

5）金黃色葡萄球菌的耐藥性分析。使用藥敏紙片進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，對(duì)丁胺卡那、卡那霉素、多西環(huán)素、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、克林霉素、青霉素、阿莫西林、頭孢氨芐、慶大霉素、鏈霉素、四環(huán)素12 種抗生素進(jìn)行耐藥性試驗(yàn)，判定標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。

表1 耐藥性試驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)

2 結(jié)果與分析

2.1 乳樣LMT 檢測(cè)結(jié)果

巴州地區(qū)八縣一市規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)1 800 頭奶牛中隱性乳房炎奶牛頭數(shù)為432 頭，患病率為24%（432/1 800），具體見(jiàn)表2；432 頭隱性乳房炎奶牛的1 728 個(gè)乳區(qū)中有1 296 個(gè)患乳房炎陽(yáng)性乳區(qū)，乳區(qū)患病率為18%（1 296/7 200）。

表2 巴州地區(qū)八縣一市抽檢奶牛乳房炎發(fā)病率

2.2 金黃色葡萄球菌菌株的分離與鑒定

37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，乳房炎陽(yáng)性分離菌株在普通肉湯培養(yǎng)基上和兔鮮血瓊脂培養(yǎng)基上均生長(zhǎng)良好。觀(guān)察在兔鮮血瓊脂培養(yǎng)基上金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的形態(tài)特征為圓形、灰白色，表面光滑、隆起、濕潤(rùn)，菌落周?chē)笑?溶血現(xiàn)象（圖3）。在普通瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)，菌落生長(zhǎng)良好，形態(tài)特征為圓形、表面光滑、隆起、濕潤(rùn)、菌落邊緣整齊，直徑大小為1.0～2.5 mm 的菌落。在金黃色葡萄球菌選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng)，菌落形態(tài)為圓形、黃色、濕潤(rùn)、邊緣整齊（圖4）。分離菌革蘭氏染色后鏡檢，觀(guān)察到圓形、革蘭陽(yáng)性，有的呈單個(gè)，有的呈短鏈狀，還有的呈現(xiàn)出葡萄串的形狀（圖5）。

圖3 血平板生長(zhǎng)情況

圖4 甘露醇生長(zhǎng)情況

圖5 顯微鏡觀(guān)察情況

2.3 生化鑒定結(jié)果

進(jìn)行生化鑒定的試驗(yàn)結(jié)果：過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)、血漿凝固酶試驗(yàn)全都為陽(yáng)性，可發(fā)酵蔗糖、麥芽糖、甘露醇。按照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》的相關(guān)知識(shí)，將分離到的菌與之對(duì)照，分離細(xì)菌的生化鑒定結(jié)果符合金黃色葡萄球菌的生化鑒定，試驗(yàn)結(jié)果判定52 株分離菌都是金黃色葡萄球菌。

2.4 分離株的16S rRNA 擴(kuò)增

對(duì)52 株奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌分離株引物擴(kuò)增16S rRNA 基因后，分離菌株均得到了大小為528 bp 的目的片段（圖6）。

圖6 金黃色葡萄球菌16S rRNA PCR 擴(kuò)增

2.5 分離株的藥敏結(jié)果

52 株金黃色葡萄球菌對(duì)青霉素、鏈霉素、環(huán)丙沙星的耐藥率為100%，對(duì)阿莫西林的耐藥率為80.8%（42/52），對(duì)慶大霉素、丁胺卡那、卡那霉素、頭孢氨芐的耐藥率為5.7%（3/52），對(duì)多西環(huán)素、克林霉素、四環(huán)素的耐藥率0%（0/52）。并出現(xiàn)了25 株菌多重耐藥性，所占比例為48%（25/52）。

3 討論

對(duì)新疆巴州地區(qū)庫(kù)爾勒市、輪臺(tái)縣、尉犁縣、若羌縣、且末縣、焉耆縣、和靜縣、和碩縣、博湖縣共八縣一市規(guī)?；膛?chǎng)各抽檢200 頭泌乳奶牛的800份乳樣，共計(jì)1 800 頭奶牛、7 200 份乳樣。1 800頭奶牛中隱性乳房炎奶牛數(shù)為432 頭，患病率為24%（432/1 800），而其他多個(gè)奶牛場(chǎng)的金黃色葡萄球菌致奶牛乳房炎發(fā)病率為30%以上[25-27]。雖然相對(duì)偏低，但也證實(shí)存在金黃色致病菌感染的病例，應(yīng)引起畜牧工作者的高度重視。432 頭隱性乳房炎奶牛的1 728 個(gè)乳區(qū)中有1 296 個(gè)患乳房炎陽(yáng)性乳區(qū)，乳區(qū)患病率為18%（1 296/7 200）。對(duì)患隱性乳房炎的奶牛乳樣進(jìn)行金黃色葡萄球菌的分離和形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)、分子水平等方面鑒定，共分離得到52 株金黃色葡萄球菌。

試驗(yàn)分離到的52 株金黃色葡萄球菌對(duì)青霉素、鏈霉素、環(huán)丙沙星的耐藥率為100%，對(duì)阿莫西林的耐藥率為80.8%（42/52），對(duì)慶大霉素、丁胺卡那、卡那霉素、頭孢氨芐的耐藥率為5.7%（3/52），對(duì)多西環(huán)素、克林霉素、四環(huán)素的耐藥率為0%（0/52）。并出現(xiàn)了25 株菌多重耐藥性，所占比例為48%（25/52），說(shuō)明耐藥性在細(xì)菌病的治療過(guò)程中是非常普遍的現(xiàn)象[28]。治療奶牛場(chǎng)中患乳房炎奶牛仍以抗生素療法為主，這引起了致病細(xì)菌耐藥性的問(wèn)題和乳制品食品安全問(wèn)題；針對(duì)細(xì)菌耐藥性問(wèn)題，可以嘗試使用中草藥、抗菌肽、噬菌體等無(wú)抗療法。研究發(fā)現(xiàn)，金黃色葡萄球菌致病力的強(qiáng)弱主要與其產(chǎn)生的侵襲性酶類(lèi)和各種毒素有關(guān)[29]。

引發(fā)奶牛乳房炎的因素是多方面的，主要分致病菌因素、管理因素和遺傳因素。不同地區(qū)引發(fā)奶牛乳房炎的致病菌的種類(lèi)存在差異，但鏈球菌、腸桿菌和金黃色葡萄球菌仍是主要的致病菌。而多數(shù)金黃色葡萄球菌菌株都攜帶腸毒素基因，嚴(yán)重影響奶牛乳腺細(xì)胞正常的生理功能[30-32]。金黃色葡萄球菌極易產(chǎn)生耐藥性，疫苗生物制劑是預(yù)防金黃色葡萄球菌乳房炎的重要手段；治療金黃色葡萄球菌乳房炎也需要一些像抗菌肽、中草藥和噬菌體等新型的無(wú)抗生素治療方案，有效避免細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，把好乳源食品安全關(guān)。飼養(yǎng)管理不當(dāng)容易導(dǎo)致奶牛養(yǎng)殖環(huán)境的溫度、濕度、通風(fēng)等不適，從而引發(fā)致病菌的滋生；擠奶廳的擠奶操作不規(guī)范，極易導(dǎo)致奶牛乳區(qū)受傷，引發(fā)致病菌從傷口感染乳區(qū)的情況出現(xiàn)；營(yíng)養(yǎng)不良或者不均衡也是導(dǎo)致奶牛乳房炎一個(gè)重要的致病因素[33]。從臨床數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，患乳房炎的奶牛的雌性后代的乳房炎患病率明顯偏高，存在遺傳物質(zhì)的影響。飼養(yǎng)環(huán)境對(duì)奶牛乳房炎的影響較大，應(yīng)做好奶牛場(chǎng)的管理工作。同時(shí)，采用某一種或者多種致病菌的單苗或者多價(jià)苗進(jìn)行免疫預(yù)防，是預(yù)防奶牛乳房炎的重要方法；搞好奶牛飼養(yǎng)圈舍和運(yùn)動(dòng)場(chǎng)的環(huán)境消毒工作非常重要，要制定針對(duì)本飼養(yǎng)場(chǎng)的消毒計(jì)劃和使用行之有效的消毒藥品；及時(shí)將患乳房炎的奶牛與其它健康的奶牛隔離飼養(yǎng)，積極治療患病奶牛，及時(shí)淘汰生產(chǎn)性能較低且患病的奶牛。

奶牛乳房炎歷史悠久，盡管生物技術(shù)在21世紀(jì)得到了不斷發(fā)展，仍很難徹底解決奶牛乳房炎問(wèn)題[34]；有研究人員通過(guò)生物技術(shù)利用金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的毒素、莢膜和侵襲性酶等細(xì)胞因子或者結(jié)構(gòu)正在努力嘗試研發(fā)多種亞單位疫苗，用于奶牛乳房炎的預(yù)防[35]。