多動安顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

衛(wèi)向鋒，孫婷婷，張 紅△，牛春玲

（1. 西安中醫(yī)腦病醫(yī)院制劑科，陜西 西安 710032； 2. 陜西省中醫(yī)藥研究院，陜西 西安 710003）

多動安顆粒為醫(yī)院制劑，由紫河車、熟地黃、石菖蒲、制遠(yuǎn)志、澤瀉、黃連、生麻黃、佛手等11 味中藥組方，具有益腎填精、寧心安神、柔肝清火的功效，用于治療缺陷障礙（多動癥）之精虧肝亢證。多動安顆粒為醫(yī)院協(xié)定處方，臨床應(yīng)用時(shí)間長，療效顯著，但藥味種類繁多且成分復(fù)雜，尚無其質(zhì)量控制方法。本研究中采用薄層色譜（TLC）法對處方中主要起作用的4 味中藥黃連、佛手、熟地黃、麻黃進(jìn)行定性鑒別，采用高效液相色譜（HPLC）法對處方中鹽酸小檗堿進(jìn)行定量檢測?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

儀器：2010－AT 型高效液相色譜儀（日本島津公司，包括UV 檢測器，LC－Solution 工作站）；UP3200H 型超聲波清洗器（熊貓集團(tuán)南京電子計(jì)量有限公司，功率150 W，頻率40 kHz）；SQP 型電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器＜北京＞有限公司，d＝0.1 mg）；JM－B 型電子天平（余姚市紀(jì)銘稱重校驗(yàn)設(shè)備有限公司，d＝1 mg）；XMTD－6000型電子恒溫不銹鋼水浴鍋（上海宜昌儀器紗篩廠）；DFT－200A 型高速粉碎機(jī)（溫嶺市林大機(jī)械有限公司）。

試藥：對照藥材黃連（批號為120913－201310）、佛手（批號為120933－201004）、熟地黃（批號為121196－201105），對照品鹽酸小檗堿（批號為713－9404）、鹽酸麻黃堿（批號為0714－9903），購自中國食品藥品檢定研究院；多動安顆粒（醫(yī)院制劑，批號為190101，190102，190103）；乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 定性鑒別

黃連：取本品6 g，研細(xì)，加甲醇25 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液作為供試品溶液；另取黃連對照藥材0.25 g，同法制備對照藥材溶液；取鹽酸小檗堿對照品適量，加甲醇制成每1 mL 含0.5 mg 的溶液，作為對照品溶液。按處方比例和制法制備缺黃連的陰性對照品溶液。照2015年版《中國藥典（四部）》通則0502 中薄層色譜法試驗(yàn)，分別精密吸取供試品溶液、對照藥材溶液與陰性對照品溶液各3 μL，對照品溶液1 μL，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素納為黏合劑的硅膠G 薄層板上，以環(huán)己烷－乙酸乙酯－異丙醇－甲醇－水－三乙胺（3 ∶3.5 ∶1 ∶1.5 ∶0.5 ∶1，V／ V／ V／ V／ V／ V）為展開劑，置用濃氨試液預(yù)飽和20 min 的展開缸內(nèi)，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視[1]。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液和對照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，且陰性對照無干擾。結(jié)果見圖1 A。

佛手：取樣品12 g，研細(xì)，加甲醇40 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL 使溶解，作為供試品溶液。另取佛手對照藥材1 g，同法制得對照藥材溶液。按處方比例依法制備陰性對照品溶液。照2015年版《中國藥典（四部）》通則0502 中薄層色譜法試驗(yàn)，吸取供試品溶液與陰性對照品溶液各5 μL、對照藥材溶液2 μL，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素納為黏合劑的硅膠G 薄層板上，以正己烷－乙酸乙酯（3 ∶1，V／ V）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視[2]。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，且陰性對照無干擾。結(jié)果見圖1 B。

熟地黃：取樣品33 g，研細(xì)，加水80 mL，煎煮30 min，用脫脂棉濾過，濾液用乙酸乙酯振搖提取3 次，每次50 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL 使溶解，作為供試品溶液。另取熟地黃對照藥材4 g，同法制備對照藥材溶液。按處方比例依法制備缺熟地黃的陰性對照品溶液[3]。照2015年版《中國藥典（四部）》通則0502 中薄層色譜法試驗(yàn)，精密吸取供試品溶液、陰性對照品溶液與對照藥材溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一羧甲基纖維素納為黏合劑的硅膠G 薄層板上，以二甲苯－乙酸乙酯（1 ∶1，V／ V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2，4－二硝基苯肼乙醇試液顯色。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，且陰性對照無干擾。結(jié)果見圖1 C。

麻黃：取樣品100 g，研細(xì)，加濃氨試液適量，加三氯甲烷100 mL，超聲處理40 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL 使溶解，作為供試品溶液。另取鹽酸麻黃堿對照品，加甲醇制成每1 mL 含1 mg 的溶液，作為對照品溶液。按處方比例依法制備缺麻黃藥材陰性對照品溶液[4]。2015年版《中國藥典（四部）》通則中0502 薄層色譜法試驗(yàn)，吸取供試品溶液與陰性對照品溶液各25 μL、對照品溶液5 μL，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G 薄層板上，以正丁醇－冰醋酸－水（8 ∶2 ∶1，V／ V／ V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以茚三酮試液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，且陰性對照無干擾。結(jié)果見圖1 D。

圖1 薄層色譜圖

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Agilent C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈－0.05 mol／L 磷酸二氫鉀溶液（50 ∶50，V／ V，每100 mL 中含十二烷基硫酸鈉0.4 g，pH ＝4.0）；檢測波長：345 nm；柱溫：35 ℃；流速：1.0 mL／min；進(jìn)樣量：10 μL。理論板數(shù)按鹽酸小檗堿峰計(jì)應(yīng)不低于5 000[5]。

2.2.2 溶液制備

取鹽酸小檗堿對照品適量，精密稱定，加甲醇制成質(zhì)量濃度為22 μg／mL 的對照品溶液。

稱取本品約0.6 g，研細(xì)，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入甲醇－鹽酸（100 ∶1，V／ V）25 mL，超聲處理30 min，補(bǔ)足減失的質(zhì)量，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

按處方比例依法制備缺黃連的陰性對照品溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：精密吸取上述3 種溶液各10 μL，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應(yīng)保留時(shí)間處有相應(yīng)色譜峰，而陰性對照無干擾。詳見圖2。

線性關(guān)系考察：分別精密吸取上述對照品溶液2，4，6，8，10，12 μL，注入液相色譜儀，測定峰面積，并以進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y＝4E ＋06X－10 797，r＝0.999 9（n ＝6）。結(jié)果表明，鹽酸小檗堿進(jìn)樣量在0.044 ～0.264 μg 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

圖2 高效液相色譜圖

精密度試驗(yàn)：取同一對照品溶液，精密吸取對照品溶液10 μL，按擬訂色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次。結(jié)果的RSD為0.061%（n ＝6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批（批號為190101）樣品適量，研細(xì)，約0.6 g，共6 份，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入甲醇－鹽酸（100 ∶1，V／ V）25 mL，超聲提取30 min，補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，用0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，按擬訂相色譜條件測定。結(jié)果平均含量為0.647mg／g，RSD為2.27%（n ＝6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一批（批號為190101）樣品0.6 g，研細(xì)，精密稱定，依法制備供試品溶液，分別在放置0，2，4，6，8，10 h 時(shí)測定。結(jié)果含量的RSD為0.085%（n ＝6），表明供試品溶液在10 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的樣品共6 份，研細(xì)，每份約0.3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，按供試品與對照品比例1 ∶1 加入鹽酸小檗堿對照品溶液，再依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，計(jì)算加樣加收率。結(jié)果見表1。

表1 鹽酸小檗堿加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n ＝6）

2.2.4 樣品含量測定

取3 批樣品（批號分別為190101，190102，190103），依法制備供試品溶液，各精密吸取10 μL，注入液相色譜儀。結(jié)果3 批樣品中鹽酸小檗堿含量分別為0.644，0.652，0.644 mg／g。

3 討論

3.1 薄層鑒別條件選擇

初期對處方中各藥材進(jìn)行定性鑒別考察。2015年版《中國藥典》中暫未收載紫河車薄層色譜鑒別標(biāo)準(zhǔn)，故未將紫河車列入薄層色譜鑒別項(xiàng)。因本處方提取方法為水煎煮法，石菖蒲、制遠(yuǎn)志及澤瀉藥材中成分大多為脂溶性成分，薄層色譜法不能鑒別其相應(yīng)成分斑點(diǎn)，故最終選擇黃連、佛手、麻黃、熟地黃作為薄層鑒別項(xiàng)。本試驗(yàn)中對麻黃藥材薄層展開劑進(jìn)行選擇，分別比較了三氯甲烷－甲醇－濃氨試液（20 ∶5 ∶0.5，V／ V／ V）和丙酮－甲醇－濃氨試液（20 ∶5 ∶0.5，V／ V／ V）[6－7]。結(jié)果表明麻黃薄層鑒別中展開劑的極性應(yīng)偏大，更換為正丁醇－冰醋酸－水（8 ∶2 ∶1，V／ V／ V），所得薄層色譜斑點(diǎn)集中，分離度良好。

3.2 含量測定指標(biāo)選擇

指標(biāo)選擇：初期根據(jù)處方中藥材的化學(xué)成分及藥理作用對含量測定指標(biāo)進(jìn)行選擇。由于遠(yuǎn)志藥材中的遠(yuǎn)志皂苷在制劑中質(zhì)量不穩(wěn)定，澤瀉藥材中乙酰澤瀉醇B在水中溶解度低，故遠(yuǎn)志和澤瀉中成分不適合作為該制劑的質(zhì)控指標(biāo)。熟地黃藥材和佛手藥材中有效成分含量較低，缺少對照品，故未將其作為質(zhì)量控制指標(biāo)。鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿為麻黃藥材中主要有效成分[8]，但由于該制劑中這2 種生物堿保留時(shí)間和含量均不穩(wěn)定，難以控制質(zhì)量，故未將其作為質(zhì)控指標(biāo)。黃連中含生物堿類成分，具有清熱燥濕、瀉火解毒功效[9]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，黃連具有降血糖、抗菌、抗氧化、抗腫瘤、抗心律失常等活性，其中鹽酸小檗堿為發(fā)揮藥效的主要有效成分[10]。黃連具有廣泛的藥理活性，用于諸多中藥制劑如黃連上清丸、一清膠囊、人參再造丸等中，故選擇黃連中鹽酸小檗堿含量作為該制劑的質(zhì)量控制指標(biāo)。

提取溶劑考察：取同一批（批號為190101）樣品適量，研細(xì)，分別加入甲醇、甲醇－鹽酸（100 ∶1，V／ V）、甲醇－鹽酸（100 ∶3，V／ V）和甲醇－鹽酸（100 ∶5，V／ V）25 mL，超聲處理30 min，用上述溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，用0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液。按擬訂色譜條件測定鹽酸小檗堿含量結(jié)果分別為0.638 0，0.637 8，0.583 6 mg／g?？梢?，采用甲醇－鹽酸（100 ∶1，V／ V）比例的溶劑提取的鹽酸小檗堿含量最高，故選擇用甲醇－鹽酸（100 ∶1，V／ V）作為樣品提取溶劑。

提取時(shí)間考察：取同一批（批號為190101）樣品適量，精密加入甲醇－鹽酸（100 ∶1，V／ V）25 mL，分別超聲提取15，30，45 min，稱定質(zhì)量，用甲醇－鹽酸（100 ∶1，V／ V）補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，取續(xù)濾液，用0.45 μm 微孔濾膜濾過，精密吸取10 μL，注入液相色譜儀，測得鹽酸小檗堿含量分別為0.571 2，0.668 0，0.667 3 mg／g?？梢姡曁崛?0 min 鹽酸小檗堿含量最高，故確定超聲提取時(shí)間為30 min。

3.3 方法評價(jià)

本研究中建立了多動安顆粒中黃連、佛手、麻黃、熟地黃的薄層色譜鑒別方法，對該制劑中鹽酸小檗堿含量進(jìn)行測定，并對方法學(xué)進(jìn)行了考察。該方法簡單，專屬性強(qiáng)、耐用性好，可用于多動安顆粒的質(zhì)量控制。