高效液相－蒸發(fā)光散射法測(cè)定芪歸益母膏中黃芪甲苷含量

熊有明，崔 虹，熊學(xué)慶

（1. 重慶市萬(wàn)州食品藥品檢驗(yàn)所，重慶 404000； 2. 重慶市萬(wàn)州區(qū)中醫(yī)院，重慶 404000）

芪歸益母膏是重慶市萬(wàn)州區(qū)中醫(yī)院研制的醫(yī)院制劑，由黃芪、當(dāng)歸、益母草、白芍4 味中藥組方，具有益氣養(yǎng)血、調(diào)經(jīng)止痛作用，主要用于治療月經(jīng)不調(diào)及痛經(jīng)等癥。黃芪為方中君藥，味甘，性微溫，具有補(bǔ)氣升陽(yáng)、固表止汗、利水消腫、生津養(yǎng)血、行滯通痹、托毒排膿、斂瘡生肌的功效。皂苷類(lèi)是黃芪的主要活性成分，以黃芪甲苷為代表，為黃芪藥材的質(zhì)量控制指標(biāo)[1]，具有降壓消炎、鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛作用，能影響血清和肝臟蛋白質(zhì)合成。該制劑現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)只有鑒別和通則檢查項(xiàng)，不能有效控制其質(zhì)量。為提高芪歸益母膏質(zhì)量的可控性和穩(wěn)定性，保證臨床用藥安全，本研究中參照2015年版《中國(guó)藥典（一部）》及文獻(xiàn)[1－6]，采用高效液相－蒸發(fā)光散射（HPLC－ELSD）法測(cè)定芪歸益母膏中黃芪甲苷的含量，為該制劑的質(zhì)量控制提供定量檢測(cè)方法?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC－20A 型高效液相色譜儀（日本島津公司），包括LC－20AT 型輸液泵，ELSD－LTⅡ型蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，CTO －20A 型柱溫箱，SIL －20A 型自動(dòng)進(jìn)樣器，LCsolution 色譜工作站；XP204 型電子天平（瑞士梅特勒－托利多公司，精度為0.1 mg）；ME215S 型電子天平（德國(guó)賽多利斯集團(tuán)，精度為0.01 mg）。

1.2 試藥

黃芪甲苷對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為110781－201314，含量為95.8%）；芪歸益母膏（重慶市萬(wàn)州區(qū)中醫(yī)院供，批號(hào)分別為20190605，20190829，20191029）；D101 型大孔吸附樹(shù)脂，正丁醇、氨水、乙醇均為分析純，均購(gòu)自成都科龍化工試劑廠；乙腈（色譜純，德國(guó)Merck 公司）；水為純化水（自制）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件[2 －6]與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Diamonsil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈－水（33 ∶67，V／ V）；流速：1.0 mL／min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSD）參數(shù)：氮?dú)鈮毫?25 kPa，漂移管溫度為40 ℃，增益為6。分別取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，按擬訂色譜條件測(cè)定，色譜圖見(jiàn)圖1。黃芪甲苷峰理論板數(shù)不低于5 000，分離度均大于1.5?？梢?jiàn)，陰性對(duì)照品對(duì)黃芪甲苷的測(cè)定無(wú)干擾，且黃芪甲苷和其他組分可達(dá)到基線分離。

2.2 溶液制備

對(duì)照品溶液：取黃芪甲苷對(duì)照品10.27 mg，精密稱(chēng)定，置50 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品貯備液。精密吸取對(duì)照品貯備液3.0 mL，置10 mL 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

圖1 高效液相色譜圖

供試品溶液[1]：取本品2 g，精密稱(chēng)定，置250 mL 分液漏斗中，加20 mL 水溶解，用水飽和正丁醇提取5 次，每次20 mL，合并正丁醇，用正丁醇飽和的氨試液洗滌2 次，每次40 mL，再用正丁醇飽和的水洗滌2 次，每次40 mL，蒸干，殘?jiān)铀? mL 使溶解，放冷，通過(guò)D101 型大孔吸附樹(shù)脂（內(nèi)徑為1.2 cm，柱高為10 cm），以水30 mL洗脫，棄去水液，再用70%乙醇100 mL 洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)蛹状既芙?，轉(zhuǎn)移至5 mL 容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

陰性對(duì)照品溶液：按處方（不含黃芪）及本品工藝制備陰性樣品，按供試品溶液項(xiàng)下方法制備，即得。

2.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：精密量取黃芪甲苷對(duì)照品貯備液0.6，1.5，3.0，4.0，6.0 mL，置10 mL 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度為11.81，29.52，59.03，78.71，118.06 mg／L 的系列對(duì)照品溶液。精密吸取上述對(duì)照品溶液各20 μL，注入高效液相色譜儀，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y＝1.440 5X＋6.101 1，r＝0.999 9（n＝5）。結(jié)果表明，黃芪甲苷進(jìn)樣量在0.236 ～2.362 μg 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：精密吸取對(duì)照品溶液（質(zhì)量濃度為59.03 mg／L）20 μL，重復(fù)進(jìn)樣6 次，記錄峰面積。結(jié)果的RSD為0.89%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為20190605）樣品，依法制備供試品溶液，分別于0，2，4，6，8，12，24 h 時(shí)進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果黃芪甲苷峰面積的RSD為0.25% （n＝7），表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為20190605）樣品，依法制備供試品溶液，平行6 份，分別進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算黃芪甲苷的含量。結(jié)果平均含量為0.210 mg／g，RSD為0.82%（n＝6），表明該方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的樣品9 份，精密稱(chēng)定，每份1 g，置250 mL 分液漏斗中，以3 份為1 組，每組分別精密加入黃芪甲苷對(duì)照品貯備液0.5，1.0，1.5 mL，依法制備供試品溶液，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 黃芪甲苷回收加樣試驗(yàn)結(jié)果（n ＝9）

2.4 樣品含量測(cè)定

取3 批樣品，依法制備供試品溶液，各精密吸取20 μL，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果批號(hào)為20190605，20190829，20191029 的樣品中黃芩甲苷平均含量分別為0.220，0.210，0.200 mg／g。

3 討論

3.1 檢測(cè)器選擇

黃芪甲苷在紫外區(qū)只有吸收度很小的末端吸收，靈敏度很差，故參照2015年版《中國(guó)藥典（一部）》方法（蒸發(fā)光散射檢測(cè)法）對(duì)芪歸益母草膏中黃芪甲苷的含量進(jìn)行測(cè)定。

3.2 供試品提取

供試品經(jīng)水飽和正丁醇提取后，考察了水洗（正丁醇飽和的水）和堿洗（正丁醇飽和的氨試液）對(duì)含量測(cè)定的影響。結(jié)果表明，堿洗含量明顯高于水洗，故選擇堿洗。

3.3 流動(dòng)相選擇

考察了甲醇－水，乙腈－水不同體系流動(dòng)相，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以乙腈－水為流動(dòng)相時(shí)，黃芪甲苷響應(yīng)度強(qiáng)，峰形好，優(yōu)化條件后，確定乙腈－水（33 ∶67，V／ V）為流動(dòng)相。

3.4 方法評(píng)價(jià)

采用HPLC－ELSD 法測(cè)定芪歸益母膏中黃芪甲苷的含量，受主客觀因素的干擾較小，準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便，重復(fù)性好，可作為芪歸益母膏的定量分析方法。該醫(yī)院制劑臨床應(yīng)用廣泛，藥效良好。本研究中采用的HPLC－ELSD法快速、準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)限低，可用于芪歸益母膏中黃芪甲苷的含量測(cè)定。建議將黃芪甲苷含量測(cè)定列入質(zhì)量控制指標(biāo)，以更好地控制該制劑的質(zhì)量。