6 種中藥飲片微生物檢測(cè)狀況分析*

李 艷，周 劍，劉 霞，朱照靜

（1. 重慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，重慶 401331； 2. 重慶市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，重慶 401121；3. 重慶市綦江區(qū)人民醫(yī)院，重慶 401420）

2015年版《中國藥典》首次收載中藥飲片的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)研粉口服用貴細(xì)飲片、直接口服及泡服飲片規(guī)定了沙門菌、耐膽鹽革蘭陰性菌的限度，其他類型飲片暫無微生物控制要求。近年來，國家藥典委員會(huì)、各級(jí)藥品監(jiān)督管理局及藥檢所等機(jī)構(gòu)都相繼組織開展了中藥飲片的微生物限度檢測(cè)及相關(guān)課題研究[1－7]。熟地黃、酒萸肉、牡丹皮、山藥、茯苓、澤瀉是中醫(yī)臨床常見可直接使用的中藥飲片，也是六味地黃丸、金匱腎氣丸等中藥制劑的處方成分。本研究中考察了重慶市最大中藥材批發(fā)市場(chǎng)銷售的以上6 種共36 批中藥飲片的微生物負(fù)載情況，為合理制訂中藥飲片微生物限度提供參考，同時(shí)為課題組后期開展微生物對(duì)六味地黃丸主要有效成分的影響作好前期工作?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

儀器：VITEK2 COMPACT 型全自動(dòng)生化鑒定儀（生物梅里埃中國有限公司）；AⅡ型生物安全柜（上海力康生物醫(yī)療科技控股有限公司）；SHH150L 型生化培養(yǎng)箱（重慶四達(dá)試驗(yàn)設(shè)備有限公司）；BX61 型生物顯微鏡（日本Olympus 公司）。

試藥：熟地黃共6 批，來源于重慶、河南；酒萸肉共6 批，來源于安徽、浙江、河北；牡丹皮共6 批，來源于安徽；山藥共6 批，來源于四川、河南；茯苓共6 批，來源于四川、云南、安徽；澤瀉共6 批，來源于四川、福建。樣品經(jīng)重慶市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院中藥室楊帆副主任藥師鑒定為正品。

培養(yǎng)基與菌株：胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、腸道菌增菌液體培養(yǎng)基、紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、RV 沙門增菌液體培養(yǎng)基及木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基，均購自中國食品藥品檢定研究院。

枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]、金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、大腸埃希菌[CMCC（B）44102]、乙型副傷寒沙門菌[CMCC（B）50094]、銅綠假單胞菌[CMCC（B）10104]、白 色 念 珠 菌[CMCC（F）98001]、黑 曲 霉[CMCC（F）98003]，均購自中國食品藥品檢定研究院。

1.2 方法

1.2.1 菌液制備[8]

根據(jù)2015年版《中國藥典（四部）》通則1107，制備枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、乙型副傷寒沙門菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌的菌懸液、黑曲霉的孢子懸液。

1.2.2 供試液制備

取各批中藥飲片適量，無菌粉碎，稱取10 g，加滅菌胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基至100 mL，使?jié)舛葹? ∶10，備用。

1.2.3 微生物計(jì)數(shù)

取1.2.2 項(xiàng)下供試液，依次10 倍遞增稀釋至1∶10000，分別吸取1 ∶10 供試液及1 ∶100，1 ∶1 000，1 ∶10 000 稀釋級(jí)樣品勻液1 mL 置平皿中，每個(gè)稀釋級(jí)平行制備2 個(gè)平皿。同時(shí)，分別吸取1 mL 空白稀釋液置2 個(gè)平皿，作為空白對(duì)照。立即倒入46 ℃瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后，置規(guī)定溫度[需氧菌采用胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）平板，培養(yǎng)溫度為33 ℃，培養(yǎng)5 d；霉菌和酵母菌采用沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA）平板，培養(yǎng)溫度為25 ℃，培養(yǎng)7 d]培養(yǎng)，觀察結(jié)果。

另取1.2.2 項(xiàng)下供試液，置沸水浴30 min 后迅速冷卻，依次10 倍遞增稀釋至1 ∶10 000，分別吸取各稀釋級(jí)樣品勻液1 mL 置平皿中，每個(gè)稀釋級(jí)平行制備2 個(gè)平皿。立即傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，凝固后，33 ℃培養(yǎng)5 d，測(cè)定耐熱菌數(shù)。

1.2.4 耐膽鹽革蘭陰性菌

分別取1 ∶10 供試液及1 ∶100，1 ∶1 000 稀釋級(jí)樣品勻液1 mL，接種至10 mL 腸道菌增菌液體培養(yǎng)基中，35 ℃培養(yǎng)48 h，取上述培養(yǎng)物分別劃線接種于紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，35 ℃培養(yǎng)24 h。同時(shí)取稀釋液1 mL 置10 mL 腸道菌增菌液體培養(yǎng)基中，與樣品平行試驗(yàn)，做陰性對(duì)照，觀察結(jié)果。

1.2.5 沙門菌

取各粉碎后的供試品10 g，置200 mL 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，35 ℃培養(yǎng)24 h，取上述培養(yǎng)物0.1 mL接種于10 mL RV 沙門增菌液體培養(yǎng)基中，35 ℃培養(yǎng)48 h，分別劃線接種于木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽培養(yǎng)基平板，35 ℃培養(yǎng)72 h，觀察結(jié)果。

陽性對(duì)照：取各粉碎后的供試品10 g，加入沙門菌[CMCC（B）50094]1 mL（含菌量約10 ～100 cfu／mL），與樣品平行試驗(yàn)，觀察結(jié)果。

陰性對(duì)照：取稀釋液10 mL，置200 mL 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，與樣品平行試驗(yàn)，觀察結(jié)果。

1.2.6 菌落鑒定

挑取需氧菌總數(shù)項(xiàng)下TSA 平板生長單個(gè)菌落，劃線于TSA 平板，35 ℃培養(yǎng)24 h，備用，待檢。取沙門菌檢查項(xiàng)下胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基培養(yǎng)物，劃線于TSA 平板，35 ℃培養(yǎng)24 h，挑取上述平板單個(gè)菌落，劃線于TSA 平板，35 ℃培養(yǎng)24 h，備用，待檢。將上述備用待檢平板培養(yǎng)物，采用生物梅里埃VITEK2 COMPACT 全自動(dòng)生化鑒定儀進(jìn)行分析，確認(rèn)污染菌種類。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為對(duì)數(shù)值，以對(duì)數(shù)值表示，采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)結(jié)果

6 種飲片共36 批樣品的TAMC 檢查結(jié)果見表1。可見，36 批飲片樣品的總體平均lgTAMC 值為1.7，最小值為0.5，最大值為3.2，表明飲片樣品的TAMC 整體水平滿足《歐洲藥典》[9]、《美國藥典》[10]和《日本藥典》[11]關(guān)于中藥飲片微生物限度的標(biāo)準(zhǔn)要求。以飲片樣品名稱為橫坐標(biāo)、lg TAMC 值為縱坐標(biāo)作箱式圖，結(jié)果見圖1?？梢?，6 種飲片中，牡丹皮的總體數(shù)值最高，污染水平較高；澤瀉、熟地黃、酒萸肉的整體污染水平較牡丹皮低，推測(cè)應(yīng)與其炮制方式有關(guān)；茯苓和山藥的總值最低，且數(shù)值分布均較窄，表明這2 個(gè)品種污染水平低，且均勻性較好，質(zhì)量較穩(wěn)定。

表1 飲片樣品的TAMC 檢查結(jié)果

圖1 飲片樣品lgTAMC 箱式圖

2.2 霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)

6 種飲片的霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)平均結(jié)果均低于10 cfu／g，故未單獨(dú)進(jìn)行列表和作圖。結(jié)果表明，6 種飲片的TYMC 負(fù)載均較低，滿足《歐洲藥典》《美國藥典》《日本藥典》的要求。檢驗(yàn)結(jié)果較預(yù)期偏低，可能與該6 種飲片的性質(zhì)與炮制方式有關(guān)，也可能與中藥飲片生產(chǎn)廠家為了降低微生物數(shù)量及活性，生產(chǎn)過程中采用射線輻照等方式進(jìn)行滅菌處理相關(guān)。

2.3 耐熱菌數(shù)計(jì)數(shù)（NAIRE）

6 種飲片共36 批樣品，總體平均lgNAIRE 值為1.1，最小值為0.5，最大值為2.3，詳見表2。由表1 和表2 可見，經(jīng)沸水浴熱處理30 min 后需氧菌負(fù)載均比未熱處理時(shí)小，但均能檢出需氧菌，提示中藥飲片即使經(jīng)煎煮后也仍存在微生物污染的風(fēng)險(xiǎn)。以飲片樣品名稱為橫坐標(biāo)、lgNAIRE 值為縱坐標(biāo)作箱式圖，結(jié)果見圖2?？梢?，牡丹皮和澤瀉的lgNAIRE 值較表1 和圖1 中l(wèi)gTAMC 值明顯降低，表明經(jīng)煎煮后，可殺滅牡丹皮和澤瀉中相當(dāng)部分的需氧菌。熟地黃、酒萸肉、茯苓、山藥的lgNAIRE 降低則不如前兩者明顯，分析原因可能是因?yàn)槭斓攸S、酒萸肉飲片在炮制過程中已用高溫蒸制，故煎煮后需氧菌負(fù)載變化不明顯；而茯苓和山藥需氧菌負(fù)載均較低，故煎煮后變化也不明顯。

表2 飲片樣品的耐熱菌檢查結(jié)果

圖2 飲片樣品lgNAIRE 箱式圖

2.4 耐膽鹽革蘭陰性菌

耐膽鹽革蘭陰性菌計(jì)數(shù)結(jié)果（N）＜10 cfu ／ g 以lg 值0.5 計(jì)，10 cfu／g ＜N＜102cfu／g 以lg 值1.5 計(jì)，102cfu／g ＜N＜103cfu／g 以lg 值2.5 計(jì)，以此類推。以飲片樣品名稱為橫坐標(biāo)、N轉(zhuǎn)化值為縱坐標(biāo)作箱式圖，結(jié)果見圖3。6 種飲片中，牡丹皮與茯苓檢出耐膽鹽革蘭陰性菌計(jì)數(shù)均為N＜10 cfu／g，其余4 種飲片僅有熟地黃和酒萸肉各有1 批次為102cfu／g ＜N＜103cfu／g，均值為10 cfu／g ＜N＜102cfu／g，檢查結(jié)果符合2015年版《中國藥典（四部）》通則1107 中對(duì)中藥提取物控制菌的規(guī)定[8]。

圖3 飲片樣品耐膽鹽革蘭陰性菌箱式圖

2.5 沙門菌

所有樣品均未檢出沙門菌。

2.6 樣品含微生物種類鑒定情況

按1.2.6 項(xiàng)下操作，牡丹皮中檢出玫瑰色庫克菌、緩慢葡萄球菌、少動(dòng)鞘氨醇單胞菌、放射根瘤菌；澤瀉中檢出淺綠氣球菌、緩慢葡萄球菌、少動(dòng)鞘氨醇單胞菌、放射根瘤菌；熟地黃中檢出泛菌屬，酒萸肉中檢出淺綠氣球菌；茯苓中檢出產(chǎn)色葡萄球菌；山藥中檢出泛菌屬、緩慢葡萄球菌、少動(dòng)鞘氨醇單胞菌。上述微生物主要為自然環(huán)境和人體中常見的微生物，在藥品生產(chǎn)、運(yùn)輸、保存過程中，進(jìn)行微生物污染種類分析，常能分離檢出，其中淺綠氣球菌常于醫(yī)院環(huán)境分離檢出，推測(cè)為特殊污染批次。

3 討論

參照2015年版《中國藥典（四部）》非無菌藥品微生物限度標(biāo)準(zhǔn)關(guān)于中藥飲片檢驗(yàn)項(xiàng)目、限度標(biāo)準(zhǔn)相關(guān)規(guī)定，按非無菌藥品微生物計(jì)數(shù)及控制菌檢查法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果符合《歐洲藥典》《美國藥典》《日本藥典》及現(xiàn)行《中國藥典》同類標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定。

6 種飲片36 批樣品中，牡丹皮和澤瀉需氧菌總數(shù)相對(duì)較高，熟地黃和酒萸肉居中，茯苓和山藥較低；6 種飲片的霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)平均結(jié)果均較低；經(jīng)煎煮后，牡丹皮和澤瀉需氧菌總數(shù)降低最明顯，熟地黃、酒萸肉、茯苓和山藥前后變化較小。分析6 種飲片的炮制方式，熟地黃和酒萸肉在炮制過程中均有高溫蒸制過程，故飲片在煎煮前后需氧菌負(fù)載變化不明顯；牡丹皮和澤瀉則無高溫蒸制過程，故飲片在煎煮前后需氧菌負(fù)載變化較明顯；而茯苓和山藥則可能因?yàn)槲廴舅降停|(zhì)量較穩(wěn)定，故煎煮前后需氧菌負(fù)載均較低。耐膽鹽革蘭陰性菌整體檢出水平均較低，沙門菌均未檢出。分離鑒定出的其他微生物為自然環(huán)境和人體中常見的微生物種類。

6 種飲片36 批樣品中，所檢出微生物數(shù)量較預(yù)期偏低。除飲片炮制工藝因素外，還可能是一些生產(chǎn)廠家在生產(chǎn)過程中采用射線輻照等方式進(jìn)行滅菌處理，造成樣品中微生物數(shù)量、活性大幅降低，導(dǎo)致檢出結(jié)果較預(yù)期偏低。

中藥飲片種類繁多、來源多樣、用途不同、加工工藝不同，不同地區(qū)中藥飲片的微生物負(fù)載差異也較大，對(duì)于中醫(yī)臨床使用和制劑生產(chǎn)使用的中藥飲片，應(yīng)根據(jù)飲片性質(zhì)、不同入藥部位、不同炮制方式、不同給藥途徑等分類制訂合適的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)。本課題組的下一步工作將考察微生物對(duì)以上6 種中藥飲片有效成分的影響，為《中國藥典》進(jìn)一步制訂中藥飲片微生物限度的補(bǔ)充提供參考。