鐵絲威靈仙質(zhì)量標準研究

楊宇慧，段超慧，王 皓，段 羚，張 婷，楊桂娥

（內(nèi)蒙古自治區(qū)包頭市食品藥品檢驗檢測中心，內(nèi)蒙古 包頭 014060）

鐵絲威靈仙為百合科植物短梗菝葜Smilax scobini-caulisC.H.Wright、華東菝葜Smilax sieboldii Miq的干燥根及根莖。短梗菝葜主產(chǎn)于河北、山西、河南等地，華東菝葜主產(chǎn)于遼寧、山東、江蘇等地[1－5]，具有祛風、除濕、散瘀、解毒等功效，主要用于治療風濕腰腿痛、瘡癤等癥。該品種收載于1988年版《內(nèi)蒙古中藥材標準》，僅對其性狀及顯微特征進行了規(guī)定，而其薄層色譜鑒別[6]、水分、雜質(zhì)、總灰分、酸不溶性灰分的測定及含量測定未作規(guī)定。完善質(zhì)量標準項目與藥物的臨床療效、穩(wěn)定性和安全性密切相關，本研究中在鐵絲威靈仙原有質(zhì)量標準基礎上，對薄層色譜鑒別、水分、灰分、含量測定等項目進行了較系統(tǒng)和全面的分析，為建立其質(zhì)量標準體系提供參考。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Sartorius BP－211D 型電子天平（精度為0.01 mg）、Sartorius BS300S－WEI 型電子天平（精度為0.1 mg）均購自北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；Mettler Toledo ME104E 型電子分析天平（瑞士梅特勒－托利多公司，精度為0.000 1 g）；Leica DM3000B 型智能顯微鏡（德國萊卡儀器有限公司）；Aglient 1260 型高效液相色譜儀（美國Aglient 公司）；KQ －700DE 型數(shù)控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為300 W，頻率為4.0 kHz）；HH－4 型數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市白塔金昌實驗儀器廠）。

1.2 試藥

短梗菝葜（編號為S1 ～S7），其中S6 和S7 號樣品為本項目組自行采集，并經(jīng)河南信陽師范學院植物學教研室朱鑫鑫講師鑒定為百合科植物短梗菝葜正品，其他批次樣品經(jīng)本中心實驗室通過性狀、顯微、薄層色譜、有效成分含量測定等方式比對，確定均為百合科植物短梗菝葜正品，于大連長山島和大黑山采集華東菝葜2 批（編號為S8 ～S9），樣品信息見表1；薯蕷皂苷元對照品（批號為111539－200001），白藜蘆醇對照品（批號為111535－201703，純度為99.4%），均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈（HPLC Grade，LOT 178509，F(xiàn)isher Chemical）；其余試劑均為分析純，水為純化水。

表1 樣品基本信息

2 方法與結果

2.1 性狀鑒別

短梗菝葜：本品根莖呈不規(guī)則塊狀，略橫向延長而彎曲，有針狀小刺，下側著生許多細長的根。根長20 ～100 cm，直徑1 ～2 mm，表面灰褐色或灰棕色，平滑，帶有細小鉤狀刺及少數(shù)須根。質(zhì)韌，不易折斷，富有彈性，斷面外圈為淺棕色環(huán)（石細胞），內(nèi)有一圈排列均勻的小孔（導管）。氣無，味淡。詳見圖1 A。

華東菝葜：根莖及根外形同短梗菝葜極相似，稍有不同處在于根粗細均勻，刺相對較少。詳見圖1 B。

圖1 短梗菝葜根及根莖

2.2 顯微鑒別

采用2015年版《中國藥典（四部）》通則2001 項下顯微鑒別法鑒別各批次樣品橫切面及粉末顯微特征。

不定根的橫切面（直徑約1.5 mm）：內(nèi)皮層外側的組織多已脫落，有時可見殘存皮層細胞。內(nèi)皮層有1 列由棕色色素的石細胞組成，細胞內(nèi)壁及側壁三面顯著增厚，胞腔小，有明顯的層紋及孔溝，中柱具初生結構，約占根的1／2。中柱鞘為9 ～13 層木化厚壁纖維，直徑17 ～40 μm，韌皮部由薄壁細胞和篩管組成，與木質(zhì)部相間排列，各15 ～25 個，呈輻射狀。木質(zhì)部由導管和木纖維組成。詳見圖2。

圖2 不定根橫切面（×100）

粉末顯微特征：取一定量樣品，粉碎，過4 號篩，采用水合氯醛透化法觀察粉末特征。本品粉末污黃色。髓細胞長方形，壁厚化，直徑18 ～76 μm，多數(shù)細胞可見有圓形或長形細小單紋孔。中柱鞘纖維直徑17 ～40 μm，壁較厚，木化。纖維單個散在，黃色或白色；一種黃棕色，次生壁極度增厚，紋孔溝分枝狀匯合；另一種次生壁略微增厚，白色孔溝明顯，胞腔較小。有梯紋和具緣紋孔導管，梯紋導管直徑20 ～160 μm，具緣紋孔導管較少見。石細胞呈類圓形、類方形或長方形，直徑約70 μm，胞腔狹細，兩側胞壁增厚，具顯著孔溝。淀粉粒單粒或2 ～8 個分粒組成的復粒，單粒呈圓形或卵圓形，臍點點狀，具層紋，但不明顯。詳見圖3。

2.3 薄層色譜鑒別（薯蕷皂苷元）

取9 批樣品粉末5 g，精密稱定，加入無水乙醇50 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液加36.5%鹽酸5 mL，加熱回流2 h，放冷，用40%氫氧化鈉溶液調(diào)至中性，揮干至無醇味，殘渣加熱水40 mL 使溶解，用二氯甲烷振搖提取2 次（40 mL，30 mL），合并提取液，揮干，殘渣加甲醇1 mL 使溶解，作為供試品溶液。取薯蕷皂苷元對照品，加甲醇制成質(zhì)量濃度為0.5 mg／mL 的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法（2015年版《中國藥典》通則0502）試驗，分別吸取上述溶液各5 μL，點于同一硅膠G 薄層板上。以環(huán)己烷－乙酸乙酯（4 ∶1，V／ V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加熱至斑點顯色清晰，置紫光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應位置上顯相同顏色的熒光斑點。色譜圖見圖4。

圖3 粉末顯微特征（×400）

圖4 鐵絲威靈仙中薯蕷皂苷元薄層色譜圖

2.4 檢查

按內(nèi)蒙古自治區(qū)中蒙藥材和炮制品標準修訂工作手冊的技術要求，對本品進行了水分、總灰分、酸不溶性灰分、浸出物的考察。測定結果見表2。

表2 水分、灰分、酸不溶性灰分及浸出物測定結果（%）

2.5 白藜蘆醇含量測定[7 －9]

2.5.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：Agela Venusil MP C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；Agilient Zorbax Elipse XDB－C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈－水（27 ∶73，V／ V）；檢測波長：308 nm；流速：1.0 mL／min；柱溫：30 ℃。理論板數(shù)按白藜蘆醇峰計應不低于8 000。色譜圖見圖5。

圖5 高效液相色譜圖

2.5.2 溶液制備

取白藜蘆醇對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL 含27 μg 的溶液，即得對照品溶液。取本品粉末（過4 號篩）約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇15 mL，密塞，超聲處理30 min，轉移上清液，濾過，殘渣加15 mL 甲醇超聲提取30 min，過濾殘渣及二次提取液，并用甲醇洗滌殘渣3 次，每次10 mL，合并所有濾液，水浴蒸至10 mL 以下，冷卻，用甲醇定容至25 mL容量瓶，搖勻，即得供試品溶液。取白藜蘆醇對照品適量，精密稱定，加甲醇制成質(zhì)量濃度為1 mg／mL 的溶液（實際配制質(zhì)量濃度為1.080 0 mg／mL），作為對照品貯備液。

2.5.3 方法學考察

線性關系考察：精密量取對照品貯備液，配制成質(zhì)量濃度為5.4，10.8，27.0，54.0，64.8，81.0 μg／mL 的系列標準溶液，按擬訂色譜條件進樣測定，以質(zhì)量濃度（X）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程Y＝31.089 62X＋5.413 56，R2＝0.999（n＝6）。結果表明，白藜蘆醇質(zhì)量濃度在5.4 ～81.0 μg／mL 范圍內(nèi)與峰面積線性關系良好。

穩(wěn)定性試驗：精密吸取同一供試品溶液（編號S3），常溫下分別于0，2，4，6，8，10，12 h 時按擬訂色譜條件進樣5 μL。結果白藜蘆醇峰面積的RSD為0.74 %（n＝7），表明供試品溶液在常溫下12 h 內(nèi)穩(wěn)定。

重復性試驗：取同一供試品（編號S3）6 份，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定，按外標法計算含量。結果的RSD為1.24 % （n＝6），表明該方法重復性良好。

精密度試驗：精密吸取供試品溶液（編號S2）5 μL，按擬訂色譜條件連續(xù)進樣6 次。結果白藜蘆醇峰面積的RSD為0.16%（n＝6），表明儀器精密度良好。

加樣回收試驗：取已知白藜蘆醇含量（0.057%）的樣品（編號S2）粉末3 份，精密稱定，分別按已知量的80%，90%，110%加入白藜蘆醇對照品，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定，按外標法計算含量。結果見表3。

表3 白藜蘆醇加樣回收試驗結果（n ＝9）

方法檢測限（LOD）及定量限（LOQ）確定：依據(jù)逐級降低濃度進樣法，測得白藜蘆醇的儀器檢出質(zhì)量濃度為0.302 4 ng／mL，參考GB／T27417－2017《合格評定化學分析方法確認和驗證指南》，采用添加標準物質(zhì)的方法獲得方法檢測限為0.26 μg／g。為增加數(shù)據(jù)可信性，采用10 倍檢出限來表示定量限，故定量限為2.6 μg／g。

耐用性試驗：采用不同廠家、不同型號色譜柱，取樣品（編號S4），精密稱定，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定，按外標計算含量。結果的RSD為0。

2.5.4 樣品含量測定

按2.5.2 項下方法制備供試品溶液，測定含量，結果見表4。可見，9 批樣品白藜蘆醇含量的平均值為0.06%?？紤]到藥材質(zhì)量差異，以9 批中平均值下浮20%確定含量限度，即0.06 % ×（1－20%）＝0.048 %，故暫定本品含白藜蘆醇（C14H12O3）不得少于0.05%。

表4 樣品中白藜蘆醇含量測定結果

3 討論

本研究中對鐵絲威靈仙的質(zhì)量進行了系統(tǒng)分析，總灰分及酸不溶性灰分數(shù)據(jù)相差較大，可能因為鐵絲威靈仙為根及根莖入藥，若采集后對其凈制不規(guī)范則可能帶入較多泥土雜質(zhì)，而我中心自行采集并凈制處理的樣品灰分值較低?？梢?，除其生長環(huán)境因素外，規(guī)范的凈制可有效降低樣品中混入的泥沙等雜質(zhì)。

薯蕷皂苷元薄層色譜鑒別中，充分考察提取條件、展開條件及點樣量對斑點的影響。經(jīng)驗證，提取樣品與薯蕷皂苷元對照品在相同位置顯相同的熒光斑點，且主斑點清晰，其他斑點分離良好，無干擾，說明該提取條件與展開條件適用于薯蕷皂苷元的薄層鑒別。

白藜蘆醇具有抗腫瘤、抗氧化、抗自由基、保護肝臟、保護心血管等功能，成為較受矚目的綠色抗癌藥物；此外，還具有調(diào)節(jié)免疫、抗病毒、抗菌、抗變態(tài)反應、輻射防護等藥用價值[10－14]。本研究中對鐵絲威靈仙藥材進行定性定量分析，發(fā)現(xiàn)樣品中白藜蘆醇含量差異較大，有必要對其質(zhì)量進行控制，且2015年版《中國藥典（四部）》中并無白藜蘆醇的含量測定方法。因此，本研究中選擇白藜蘆醇作為定量測定成分，方法簡單，準確可靠，樣品的收集具有一定代表性，在此基礎上可制訂鐵絲威靈仙藥材的質(zhì)量標準。