雙黃連片高效液相色譜指紋圖譜的建立及聚類(lèi)分析和主成分分析

唐佩琴

（中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九○○醫(yī)院藥學(xué)科，福建 福州 350000）

雙黃連片由連翹、黃芩、金銀花3 味藥材按2 ∶1 ∶1的處方配比制備而得，具有疏風(fēng)解表、清熱解毒之功效，臨床用于治療外感風(fēng)熱所致感冒[1]，收載于2015年版《中國(guó)藥典（一部）》?，F(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分別采用3 種不同的色譜條件和不同的樣品前處理來(lái)檢測(cè)黃芩苷、綠原酸及連翹苷3 種成分的含量，操作煩瑣。目前，已有關(guān)于雙黃連制劑包括口服液、顆粒劑、粉針劑等劑型的質(zhì)量控制分析[2－4]，但鮮有雙黃連片的多成分質(zhì)量控制。中藥制劑是多種藥材的內(nèi)在多活性成分多靶點(diǎn)協(xié)同起效，僅對(duì)單一成分定量分析并不能準(zhǔn)確判斷其質(zhì)量和療效。中藥指紋圖譜可系統(tǒng)、科學(xué)、全面、綜合地反映中藥復(fù)方制劑的整體性，是一種半定量鑒別技術(shù)，強(qiáng)調(diào)對(duì)圖譜共有峰歸屬的辨識(shí)和圖譜相似性評(píng)價(jià)，已成為國(guó)際認(rèn)可化的質(zhì)量評(píng)價(jià)模式，廣泛應(yīng)用于中藥產(chǎn)品質(zhì)量一致性和穩(wěn)定性評(píng)價(jià)。主成分分析法是將指紋圖譜中的多指標(biāo)信息轉(zhuǎn)換成綜合指標(biāo)，達(dá)到簡(jiǎn)化綜合分析的目的[5－7]。本研究中共收集了2 個(gè)不同生產(chǎn)廠家12 批次雙黃連片，建立了高效液相色譜指紋圖譜，共確定18 個(gè)共有峰，并采用聚類(lèi)分析及主成分分析法考察雙黃連片的質(zhì)量特征，確定引起質(zhì)量差異的特征色譜峰，為系統(tǒng)評(píng)價(jià)雙黃連片的質(zhì)量提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

儀器：Agilent 1260 型高效液相色譜儀，包括G1311A 四元梯度泵、G1329A 自動(dòng)進(jìn)樣器、G1314BDAD 檢測(cè)器、G1316A 柱溫箱、Agilent－Chemistation 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（安捷倫科技有限公司）；AUW－220D 型電子天平（美國(guó)島津公司，精度為0.01 mg）；KQ－250DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山超聲波儀器有限公司，功率為500 W，頻率為50 kHz）；Milli－QAcademic 型超線水系統(tǒng)（默克密理博公司）。

試藥：雙黃連片（編號(hào)S1 ～S5，哈爾濱圣泰生物制藥有限公司，批號(hào)分別為20180611，20180907，20181105，20181211，20190122；編號(hào)S6 ～S12，藥都制藥集團(tuán)股份 有限公司，批號(hào)分別為190103，190212，190317，190425，190521，190602，190705）；綠原酸對(duì)照品（批號(hào)為110753－201817，含量為96.8%），木犀草苷對(duì)照組（批號(hào)為111720－201609，含量為94.9%），連翹酯苷A對(duì)照品（批號(hào)為111810－201707，含量為97.2），連翹苷對(duì)照品（批號(hào)為110821－201816，含量為95.1%），黃芩苷對(duì)照品（批號(hào)為110715－201821，含量為95.4%），漢黃芩苷對(duì)照品（批號(hào)為112002－201702，含量為98.5%），黃芩素對(duì)照品（批號(hào)為111595－201607，含量為98.5%），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙腈（批號(hào)為AS184407），甲醇（批號(hào)為MS1923814）均為色譜純，均購(gòu)自美國(guó)Merck 公司，甲酸（分析純，批號(hào)為20190517，西隴科學(xué)股份有限公司）；水為超純水。

2 方法與結(jié)果[8 －10]

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax－C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）－0.07%甲酸溶液（B），梯度洗脫（0 ～12 min 時(shí)8% →16%A，12 ～20 min 時(shí)16% →25%A，20 ～26 min 時(shí)25% →30%A，26 ～33 min 時(shí)30%→35%A，33 ～42 min 時(shí)35%→55%A，42 ～46 min時(shí)55%A，46 ～68 min 時(shí)55%→75%A）；分段切換波長(zhǎng)：320 nm（0 ～32 min，綠原酸和木犀草苷），220 nm（32 ～46 min，連翹酯苷A 和連翹苷），275 nm（46 ～68 min，黃芩苷、漢黃芩苷及黃芩素）；流速：0.9 mL／min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；色譜記錄時(shí)間：68 min。

2.2 溶液制備

取綠原酸、木犀草苷、連翹酯苷A、連翹苷、黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷對(duì)照品各適量，精密稱(chēng)定，用60%甲醇溶液溶解并配制成每1 mL 含綠原酸0.037 5 mg、木犀草苷0.087 9 mg、連翹酯苷A 0.288 5 mg、連翹苷0.143 6 mg、黃芩苷0.134 7 mg、漢黃芩苷0.108 2 mg、黃芩素0.066 4 mg 的混合對(duì)照品溶液，避光、冰箱冷藏保存，備用。取樣品20 片，研細(xì)，取約1.0 g，精密稱(chēng)定，置50 mL 棕色容量瓶中，加入60%甲醇溶液35 mL，恒溫超聲處理（功率為450 W，頻率為40 kHz）45 min，取出，放冷，加60%甲醇溶液至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

精密度試驗(yàn)：取同一混合對(duì)照品溶液，按擬訂色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 針（每針10 μL），記錄指紋圖譜，以連翹酯苷A 為參比峰。結(jié)果各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD＜1.2%（n ＝6），相對(duì)峰面積的RSD＜2.2%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為20181211）樣品，依法制備供試品溶液，在室溫放置0，3，6，9，12，18，24 h時(shí)按擬訂色譜條件進(jìn)樣分析，記錄指紋圖譜，以連翹酯苷A 峰為參比峰。結(jié)果各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD＜1.8%（n ＝6），相對(duì)峰面積的RSD＜2.0% （n＝6），表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為20181211）樣品，依法制備供試品6 份，研細(xì)，過(guò)篩（80 目），取細(xì)粉，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄指紋圖譜，以連翹酯苷A 為參比峰。結(jié)果各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD＜1.3%，相對(duì)峰面積的RSD＜2.5% （n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

2.4 高效液相色譜指紋圖譜的建立

取樣品（編號(hào)S1 ～S12），研細(xì)，過(guò)80 目篩，取細(xì)粉，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，采用2012年版《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》以下簡(jiǎn)稱(chēng)《評(píng)價(jià)系統(tǒng)》對(duì)12 份指紋圖譜進(jìn)行分析。結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.5 相似度評(píng)價(jià)分析

采用《評(píng)價(jià)系統(tǒng)》，以供試品高效液相色譜指紋圖譜為參照，進(jìn)行整體相似度評(píng)價(jià)。結(jié)果來(lái)自2 個(gè)廠家的12批供試品溶液的指紋圖譜相似度為0.913 ～0.984，表明各批次間各成分含量存在差異。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.6 共有峰指認(rèn)

12 批供試品溶液高效液相色譜指紋圖譜中共確定18 個(gè)共有峰，與圖1 C 比對(duì)，指認(rèn)出7 個(gè)成分，8 號(hào)峰為綠原酸、12 號(hào)峰為木犀草苷、13 號(hào)峰為連翹酯苷A、14號(hào)峰為連翹苷、16 號(hào)峰為黃芩苷、17 號(hào)峰為漢黃芩苷和18 號(hào)峰為黃芩素。比對(duì)色譜峰相對(duì)保留時(shí)間和分離度等因素，發(fā)現(xiàn)保留時(shí)間34.22 min 處的13 號(hào)峰位置適中，與前后色譜峰分離完全，且信號(hào)強(qiáng)度最大，故選擇13 號(hào)峰（連翹酯苷A）為參照，計(jì)算其他共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積及其RSD。結(jié)果見(jiàn)表2。

2.7 聚類(lèi)分析[11 －12]

將12 批樣品18 個(gè)共有峰的相對(duì)峰面積數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，采用離差平方和法（Ward 法），以歐氏距離平方（SED）為測(cè)度，采用系統(tǒng)聚類(lèi)分析法進(jìn)行模式識(shí)別分析。結(jié)果見(jiàn)圖2。根據(jù)聚類(lèi)分析樹(shù)狀圖，類(lèi)間距離為5 時(shí)，12 批樣品被分成了兩大類(lèi)：樣品S1 ～S5與對(duì)照指紋圖譜相似度小于0.94，樣品S6 ～S12 與對(duì)照指紋圖譜相似度大于0.95。可見(jiàn)，聚類(lèi)分析結(jié)果與相似度結(jié)果基本一致，同一廠家聚為一類(lèi)，不同廠家的產(chǎn)品所含成分存在差異，而同一廠家各成分含量均勻、穩(wěn)定，可能與廠家藥材來(lái)源、采收和生產(chǎn)加工工藝有關(guān)。

圖1 高效液相色譜指紋圖譜

表1 12 批雙黃連片樣品相似度評(píng)價(jià)結(jié)果

表2 12批樣品高效液相色譜指紋圖譜共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積

圖2 12 批樣品聚類(lèi)分析樹(shù)狀圖

2.8 主成分分析[13 －14]

以指紋圖譜中18 個(gè)共有峰的峰面積為變量，構(gòu)建19×18 的原始數(shù)據(jù)矩陣，采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)12 批樣品主成分進(jìn)行分析。結(jié)果見(jiàn)表3 和表4?？梢?jiàn)，提取的2 個(gè)主成分特征值均大于1，且累計(jì)方差貢獻(xiàn)率達(dá)92.242%，2 個(gè)主成分足以解釋18 個(gè)共有峰的主要特征和信息。主成分1 主要反映綠原酸、木犀草苷、連翹酯苷A、連翹苷、黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷的信息，峰9、峰11、峰15 對(duì)主成分2 貢獻(xiàn)率較大。

表3 2 個(gè)主成分的特征值及方差貢獻(xiàn)率

表4 初始因子載荷矩陣

3 討論

3.1 測(cè)定目標(biāo)成分選擇

雙黃連片處方中連翹、金銀花和黃芩的用量比為2 ∶1 ∶1，連翹具有抗菌、強(qiáng)心、利尿等藥理作用，主要含有連翹酯苷、連翹苷、齊墩果酸及揮發(fā)油等成分。其中，連翹脂苷是連翹中最主要的抗菌活性成分[15]，也是雙黃連片主要的質(zhì)控指標(biāo)成分之一。黃芩具有瀉火、除濕熱的功效，是涼血解毒、清熱燥濕的要藥，故選取黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素等黃酮類(lèi)化合物作為制劑中黃芩藥材的質(zhì)控指標(biāo)[16]。金銀花具有抑菌、抗病毒、抗炎、解熱作用，特征成分綠原酸和木犀草苷在高效液相色譜圖中可清晰分辨[17]。

3.2 色譜條件選擇

采用DAD 檢測(cè)器在190 ～400 nm 波長(zhǎng)紫外光區(qū)對(duì)對(duì)照品溶液進(jìn)行了全波長(zhǎng)掃描；考察了乙腈－水、甲醇－水、乙腈－磷酸水、甲醇－磷酸水、乙腈－甲酸溶液、甲醇－甲酸溶液流動(dòng)相系統(tǒng)不同梯度洗脫條件；對(duì)Shimadzu VP－ODS 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），Diamonsil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），Agilent Zorbax－C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱進(jìn)行了優(yōu)選；篩選0.6，0.8，0.9，1.0，1.2 mL ／ min 的流速，以及柱溫25，30，35 ℃。最終按擬訂色譜條件進(jìn)樣，各色譜峰信息最多，各成分分離情況良好，可用于雙黃連片的指紋圖譜分析。

本研究中建立的雙黃連片高效液相色譜指紋圖譜，提取到18 個(gè)共有峰，以13 號(hào)峰（連翹酯苷A）為參照峰，計(jì)算其他各共有峰的相對(duì)峰面積，并進(jìn)行了聚類(lèi)分析和主成分分析。利用降維思想，將較多原始變量綜合成較少變量的主成分分析，能系統(tǒng)、客觀地反映出其內(nèi)在質(zhì)量信息及引起不同批次雙黃連片差異的主要原因，方法簡(jiǎn)便、實(shí)用，可作為評(píng)價(jià)雙黃連片質(zhì)量的參考依據(jù)。