聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法篩選龍膽栽培品最佳采收期*

吳艷蓉，賈凌云

（1. 遼寧省沈陽(yáng)市肛腸醫(yī)院藥劑科，遼寧 沈陽(yáng) 110002； 2. 沈陽(yáng)藥科大學(xué)中藥學(xué)院，遼寧 本溪 117004）

采收期是指中藥材的采收時(shí)間，中藥材的采收期對(duì)其有效成分含量、制劑質(zhì)量、臨床療效等均有直接影響[1]。龍膽始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為中品。陶弘景曰：“……根狀似牛膝，味甚苦，故以膽為名?！敝兴廄埬憺辇埬懣浦参飾l葉龍膽Gentiana manshuricaKitag.、龍膽Gentiana scabraBge、三花龍膽Gentiana trifloraPall. 或堅(jiān)龍膽Gentiana rigescensFranch. 的干燥根和根莖[2]。本研究中應(yīng)用以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)，建立了遼寧省道地藥材龍膽Gentiana scabraBge.栽培品的種質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)，并確定了篩選的龍膽栽培品最佳采收期?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 龍膽栽培品種質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)的建立

1.1 儀器與試藥

儀器：PTC100TM型PCR 儀（Programmable Thermal Controller MJ Research Inc USA）；DYY－Ⅲ23A 型電泳槽，ECP3000 型三恒多用電泳儀（北京六一儀器廠）；TGL－16G 型臺(tái)式高速離心機(jī)（上海醫(yī)用分析儀器總廠）；UV755B 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海分析儀器總廠）。

試藥：十二烷基硫酸鈉（SDS） 提取緩沖液[100 mmol／L NaCl，50 mmol／L 乙二胺四乙酸（EDTA，pH 8.0），50 mmol／L 三（羥甲基）氨基甲烷（Tris－HCl，pH 8.0），0.5%SDS，0.8% β－Me，dNTPs，緩 沖 液（buffer）]，Taq DNA 聚 合 酶，隨 機(jī) 擴(kuò) 增 多 態(tài) 性DNA（RAPD）隨機(jī)引物，溴化乙啶（EB），均購(gòu)自上海生物工程有限公司；DNA Maker 購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；蒸餾水為無(wú)菌重蒸餾水，其余試劑均為分析純。龍膽栽培品（共5 批，產(chǎn)地均為遼寧省清原縣）；堅(jiān)龍膽對(duì)照藥材（批號(hào)為120988－200403），龍膽對(duì)照藥材（批號(hào)為121530－201602），龍 膽 苦 苷 對(duì) 照 品（批 號(hào) 為110770－201716），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。

1.2 方法學(xué)考察

供試品提取溶劑的制備：分別采用SDS 法、CTAB法、高鹽低pH 法提取龍膽藥材，將提取的總DNA 溶液稀釋后，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)于260 nm 及280 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（A）。結(jié)果SDS 法最佳，詳見(jiàn)表1。

表1 SDS 法提取紫外檢測(cè)結(jié)果

模板、引物、酶用量對(duì)RAPD 擴(kuò)增的影響：結(jié)果見(jiàn)表2?？梢?jiàn)，確定RAPD 擴(kuò)增最佳條件為模板含量28 ～30 ng，引物量20 ng，酶用量1.5 ～2.0 U，94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃10 s，36 ℃35 s，72 ℃70 s，43 個(gè)循環(huán)，72 ℃保溫5 min[3]。

表2 模板、引物、酶用量考察結(jié)果

1.3 溶液制備

取0.2 g 供試藥材，置研缽，用液氮冷卻，研成細(xì)粉，置2 mL Epperdorf 管中，加入400 μL SDS 提取緩沖液，56 ℃溫浴30 min，加入等體積的苯酚－氯仿－異戊醇（25 ∶24 ∶1，V／ V／ V）抽提，混勻，以10 000 r／min 離心5 min，吸取上清液，置另1 支2 mL Epperdorf 管中，用上述抽提液重復(fù)抽提，直至蛋白沉淀完全為止，吸取上清液，與2 倍體積無(wú)水乙醇混勻[3]，于－20 ℃放置20 min，離心，得沉淀。用70%乙醇洗滌2 次，干燥，溶于無(wú)菌重蒸餾水中，得供試品溶液。分別取堅(jiān)龍膽及龍膽對(duì)照藥材各0.2 g，依法分別制成對(duì)照藥材溶液。

1.4 DNA 擴(kuò)增與檢測(cè)結(jié)果

分別以供試品溶液及對(duì)照品溶液為模板，引物為50 種RAPD 隨機(jī)引物，進(jìn)行RAPD 反應(yīng)，反應(yīng)總體積為25 μL，置PTC－100 型PCR 儀上擴(kuò)增。反應(yīng)成分：buffer（Mg2＋），400 μm dNTPs，2 U Taq 酶，20 ng 引物，30 ng 模板；反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃10 s，36 ℃35 s，72 ℃70 s，43 個(gè)循環(huán)，72 ℃保溫5 min。反應(yīng)結(jié)束后，通過(guò)1.4%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，在紫外透射反射條件下觀察結(jié)果、照相，并將擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度與DNA Marker進(jìn)行比較[3]。結(jié)果在與對(duì)照藥材龍膽相應(yīng)位置出現(xiàn)相同的條帶，與對(duì)照藥材堅(jiān)龍膽有顯著差異，可作為龍膽（栽培品）的種質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)。龍膽DNA 指紋圖譜見(jiàn)圖1。

圖1 龍膽DNA 指紋圖譜

2 龍膽栽培品最佳采收期的確定

2.1 儀器與試藥

儀器：LC－10AT 型高效液相色譜儀（日本島津公司）；Diamosil C18柱（迪馬公司）；DL－360 型超聲波清洗器（浙江省象山縣石浦海天電子儀器廠，功率為180 W，頻率為30 ～40 kHz）。

試藥：甲醇（色譜純，山東禹王實(shí)業(yè)有限公司化工分公司）；純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）。生長(zhǎng)年限為2 ～5年的龍膽栽培品。

2.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Diamosil C18柱（200 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇－水（24 ∶76，V／ V）；流速：1.0 mL／min；檢測(cè)波長(zhǎng)：270 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。理論板數(shù)按龍膽苦苷峰計(jì)不低于3 000，與相鄰峰的分離度大于1.5，系統(tǒng)適用性良好。

2.3 溶液制備

對(duì)照品溶液：取龍膽苦苷對(duì)照品2 mg，精密稱(chēng)定，置10 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，制成質(zhì)量濃度為0.2 g／L 的溶液，即得[2]。

供試品溶液：取龍膽粉末0.5 g（過(guò)4 號(hào)篩），精密稱(chēng)定，精密量取甲醇20 mL，置同一具塞錐形瓶中并稱(chēng)定質(zhì)量，加熱回流15 min，放冷，再稱(chēng)定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，濾液備用，精密量取續(xù)濾液2 mL，置10 mL 容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得[2]。

2.4 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：取龍膽苦苷對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加甲醇分別制得質(zhì)量濃度為0.05，0.10，0.20，0.40，0.80 g／L 的對(duì)照品溶液，分別精密吸取10 μL，注入高效液相色譜儀，測(cè)定峰面積。以龍膽苦苷質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)、相應(yīng)峰面積（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回 歸 方 程Y＝600 722 882.258 1X＋3 401 944.5，r2＝0.999 6（n＝5）。結(jié)果表明，龍膽苦苷質(zhì)量濃度在0.05 ～0.80 g／L 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：精密吸取同一對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6 次，每次10 μL，記錄龍膽苦苷峰面積。結(jié)果的RSD為1.52%（n ＝6），表明儀器精密度符合要求。

重復(fù)性試驗(yàn)：取6 份樣品各0.5 g，精密稱(chēng)定，依法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定龍膽苦苷的含量。結(jié)果的RSD為1.61%（n ＝6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密吸取同一供試品溶液，分別于0，1，2，4，8，12 h 時(shí)進(jìn)樣測(cè)定，記錄龍膽苦苷峰面積。結(jié)果的RSD為1.96%（n ＝6），表明供試品溶液在制備后12 h 內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的樣品0.5 g，精密稱(chēng)定，共3 份，按高、中、低分別加入龍膽苦苷對(duì)照品，依法制備供試品溶液，依法測(cè)定并計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表3。

2.5 樣品含量測(cè)定

取經(jīng)篩選的龍膽栽培品，精密稱(chēng)定，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，色譜圖見(jiàn)圖2。5 批樣品的含量分別為4.29%，4.53%，4.48%，4.27%，3.93%。

表3 龍膽苦苷加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n ＝9）

圖2 高效液相色譜圖

2.6 最佳采收期確定

4 個(gè)批次不同采收季節(jié)和4 個(gè)批次不同生長(zhǎng)年限的龍膽栽培品中龍膽苦苷的含量變化見(jiàn)圖3。

3 討論

中醫(yī)取龍膽苦寒之性，瀉肝膽實(shí)火，除下焦?jié)駸醄4]。東北的關(guān)龍膽以產(chǎn)量最大、質(zhì)量最好成為藥材市場(chǎng)的主流而行銷(xiāo)全國(guó)，并有出口[5－6]。中藥龍膽中最主要的有效成分為龍膽苦苷等環(huán)烯醚萜苷類(lèi)化合物[7－8]，具有抗病毒、抗腫瘤、保肝利膽等生物活性[6]。故本研究中以龍膽苦苷為指標(biāo)成分，對(duì)應(yīng)用PCR 法進(jìn)行篩選的遼寧省道地藥材龍膽Gentiana scabraBge. 栽培品進(jìn)行最佳采收期研究。

關(guān)于龍膽苦苷的HPLC 含量測(cè)定方法，以甲醇－磷酸水溶液系統(tǒng)為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，270 nm 為檢測(cè)波長(zhǎng)[9]；以乙腈－磷酸水溶液系統(tǒng)為流動(dòng)相，240 nm 為檢測(cè)波長(zhǎng)[10－11]；文獻(xiàn)[12－16]和2015年版《中國(guó)藥典（一部）》中均以甲醇－水系統(tǒng)為流動(dòng)相，270 ～275 nm 為檢測(cè)波長(zhǎng)測(cè)定龍膽苦苷。本研究中參考以上文獻(xiàn)，對(duì)龍膽苦苷測(cè)定方法進(jìn)行篩選，最終確定甲醇－水（24 ∶76，V／ V）為流動(dòng)相，以270 nm 為檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖3 不同采收季節(jié)和生長(zhǎng)年限龍膽栽培品中龍膽苦苷含量

由龍膽苦苷的含量測(cè)定結(jié)果可見(jiàn)，秋季采收的龍膽栽培品中龍膽苦苷含量高于春季采收的龍膽栽培品，但二者含量均高于2015年版《中國(guó)藥典（一部）》龍膽藥材項(xiàng)下規(guī)定的龍膽苦苷含量[2]，故春秋兩季均可采收。生長(zhǎng)年限為2 ～5年的龍膽栽培品中，以3年生長(zhǎng)龍膽苦苷含量最高，故確定龍膽栽培品的最佳生長(zhǎng)期為3年。

近年來(lái)，我國(guó)野生中藥材資源呈明顯下降趨勢(shì)，特別是道地藥材的野生資源日益匱乏，拯救和保護(hù)瀕危中藥材資源刻不容緩，沒(méi)有科學(xué)指導(dǎo)的移栽品更是降低了臨床療效[11，17]。優(yōu)良的種質(zhì)資源是道地藥材品質(zhì)形成的內(nèi)因，對(duì)優(yōu)良種質(zhì)資源進(jìn)行篩選和深入研究，有助于對(duì)道地藥材優(yōu)良品種的推廣和發(fā)展。RAPD 是目前用于作物種質(zhì)資源鑒定的一種分子標(biāo)記技術(shù)[18]。PCR 法是DNA 分子水平PCR，被稱(chēng)為檢測(cè)基因多態(tài)性的常規(guī)技術(shù)，代表中藥品種變異類(lèi)型的遺傳標(biāo)記。故本研究中采用PCR 法測(cè)定龍膽種質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)。應(yīng)用PCR法篩選龍膽栽培品簡(jiǎn)單易行，結(jié)果可靠，可據(jù)此探索建立道地中藥材種子的PCR 法篩選標(biāo)準(zhǔn)，以篩選優(yōu)良的中藥材種質(zhì)資源，推廣道地中藥材的規(guī)范化種植。這對(duì)于挽救中藥資源的流失和枯竭，促進(jìn)中藥資源的保護(hù)和發(fā)展，提高中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制訂水平均有重要意義。