均勻設(shè)計結(jié)合藥效學(xué)優(yōu)選酸棗仁復(fù)方提取工藝

李 建，朱 杰，全彥濤，于立芹，張華南

（1. 河南省生物技術(shù)開發(fā)中心，河南 鄭州 450002； 2. 河南省植物天然產(chǎn)物開發(fā)工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450002）

酸棗仁復(fù)方是河南省生物技術(shù)開發(fā)中心實驗室從臨床治療失眠癥經(jīng)方中篩選出的，以酸棗仁、百合、茯苓、大棗等組成的，具有鎮(zhèn)靜催眠功效的藥食兩用中藥復(fù)方。復(fù)方中君藥酸棗仁味酸、甘，性平，具有養(yǎng)心益肝、安神、斂汗之功效，為治療心肝血虛之心悸、失眠要藥[1]，占比最高；百合具有潤肺止咳、寧心安神功效；茯苓具有滲濕利尿、寧心安神功效，可治療心脾兩虛、心腎不交之失眠諸證[2]；大棗具有補(bǔ)中益氣、養(yǎng)血安神之功效。中藥復(fù)方藥效的影響因素眾多，提取方法為重要因素?！夺t(yī)學(xué)源流論》曰：“煎藥之法，最宜深講，藥之效不效，全在乎此?！敝兴幏絼﹤鹘y(tǒng)提取方法多為水煎，而現(xiàn)代研究多認(rèn)為高體積分?jǐn)?shù)的乙醇對活性成分提取率較高[3]。為達(dá)到最佳藥效，本試驗中以延長戊巴比妥誘導(dǎo)小鼠睡眠時間為考察指標(biāo)，通過均勻設(shè)計法優(yōu)選酸棗仁復(fù)方的提取工藝，為其工業(yè)生產(chǎn)和臨床應(yīng)用提供參考?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動物

儀 器：CP224C 型 電 子 天 平（精 度 為0.1 mg），STX220 型便攜式天平（精度為0.1 g），均購自奧豪斯儀器＜上海＞有限公司；SB2100 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛朗儀器有限公司）。

試藥：百樂眠膠囊（揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號為17032841）；戊巴比妥鈉（上海西唐生物科技有限公司，德國進(jìn)口分裝，純度大于99%，批號為20170527）；炒酸棗仁為鼠李科植物酸棗Ziziphus jujubaMill.var.Spinosae （Bunge）Hu ex H.F.Chou 的干燥成熟種子（產(chǎn)自廣西），百合為百合科植物卷丹Lilium lancifoliumThunb、百合Lilium browniiF.E.Brown var.viridulum Baker或細(xì)葉百合L.pumilum DC. 的干燥肉質(zhì)鱗莖（產(chǎn)自浙江），茯苓為多孔菌科真菌Wolfiporiacocos（Schwein.）的干燥菌核（產(chǎn)自云南），大棗為鼠李科植物棗Ziziphus jujubaMill. 的干燥成熟果實（產(chǎn)自河南），均購自河南省世通醫(yī)藥有限公司，經(jīng)河南省生物技術(shù)開發(fā)中心趙天增研究員鑒定為正品，經(jīng)檢測均符合2015年版《中國藥典（一部）》相關(guān)項下要求。

動物：SPF 級雌性昆明種小鼠80 只，體質(zhì)量為18 ～22 g，由湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司提供，許可證號為SCXK（湘）2016－0002。自由飲水和攝食，12 h 晝夜節(jié)律變換，相對濕度為50% ～70%，溫度為（23±1）℃。試驗過程均符合動物倫理學(xué)要求。

1.2 方法

1.2.1 組方設(shè)計與提取

采用均勻設(shè)計法，選用U*6（64）均勻設(shè)計表，以乙醇體積分?jǐn)?shù)（因素A）、溶劑用量（因素B）、提取時間（因素C）為考察因素，每因素設(shè)置6 個水平，共有6 種提取工藝組合，各水平提取工藝見表1。復(fù)方中酸棗仁、百合、茯苓、大棗比例為50 ∶27 ∶19 ∶13。按此比例，準(zhǔn)確稱量各藥材，將各藥材混合，按均勻設(shè)計表工藝提取，提取次數(shù)均為2 次，過濾后合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，干燥，計算干膏得率。

表1 提取工藝均勻試驗設(shè)計

1.2.2 動物分組與給藥

將小鼠隨機(jī)分為8 組，分別為組方1 組至組方6組、空白對照組、百樂眠膠囊組，每組10 只。組方1 組至組方6 組根據(jù)干膏得率折算小鼠給藥劑量，分別為1.26，1.35，1.11，1.15，0.85，1.08 g／kg，百樂眠膠囊給藥劑量為0.31 g／kg。各組藥物以0.5%CMC－Na 溶液配制，空白對照組灌胃0.5%CMC－Na 溶液。各組小鼠灌胃溶液體積均為10 mL／kg。

1.2.3 藥效學(xué)試驗

自主活動試驗：小鼠連續(xù)灌胃15 d。試驗第1 周、第2 周分別進(jìn)行小鼠自主活動測試。測試前1 d 禁食16 h。給藥30 min 后，將小鼠置紙箱內(nèi)，使其適應(yīng)2 min 后，記錄后5 min 內(nèi)活動次數(shù)（爬行格數(shù)）、站立次數(shù)（雙前肢向上抬舉次數(shù)）和理毛次數(shù)。

直接睡眠試驗：小鼠連續(xù)灌胃15 d，觀察給藥后是否出現(xiàn)睡眠現(xiàn)象。睡眠以翻正反射消失為指標(biāo)。當(dāng)小鼠置于背臥位時，能立即翻正身位。如超過30 ～60 s 不能翻正者，即認(rèn)為翻正反射消失，進(jìn)入睡眠。翻正反射恢復(fù)即為動物覺醒，翻正反射消失至恢復(fù)這段時間為動物睡眠時間。記錄空白對照組與各給藥組入睡動物數(shù)。

延長戊巴比妥鈉誘導(dǎo)睡眠時間試驗：小鼠連續(xù)灌胃15 d。試驗前1 d 禁食16 h。給藥后30 min，各組小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉60 mg／kg，注射溶液量為10 mL／kg，以翻正反射消失為指標(biāo)，觀察各藥物能否延長戊巴比妥鈉誘導(dǎo)小鼠睡眠時間。以翻正反射消失至恢復(fù)這段時間計為睡眠時間。

戊巴比妥鈉閾下劑量催眠試驗：小鼠連續(xù)灌胃15 d。試驗前1 d 禁食16 h。給藥后30 min，各組小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉最大閾下催眠劑量40 mg／kg，記錄30 min內(nèi)入睡動物數(shù)（翻正反射消失達(dá)1 min 以上者）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 16.0 統(tǒng)計學(xué)軟件分析。計量資料以表示，經(jīng)正態(tài)分布檢驗后進(jìn)行比較，各組間比較采用單因素方差分析。P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。相關(guān)性分析采用Pearson 法。均勻試驗設(shè)計的提取工藝優(yōu)化采用DPS 多元回歸分析，得回歸方程與最優(yōu)解。

2 結(jié)果

2.1 干膏得率

根據(jù)均勻設(shè)計試驗條件進(jìn)行復(fù)方提取，組方1 至組方6 的 干 膏 得 率 分 別 為22.3% ，23.9% ，19.5% ，20.3%，14.9%，19.1%。可見，不同提取條件下干膏得率差異較大。

2.2 藥效學(xué)試驗結(jié)果

表2 各組小鼠體質(zhì)量比較（±s，g，n ＝10）

表2 各組小鼠體質(zhì)量比較（±s，g，n ＝10）

組別試驗開始前試驗第1 周試驗結(jié)束時組方1 組組方2 組組方3 組組方4 組組方5 組組方6 組空白對照組百樂眠組21.7 ±0.30 21.7 ±0.30 21.7 ±0.42 21.7 ±0.30 21.7 ±0.30 21.7 ±0.30 21.8 ±0.32 21.9 ±0.74 30.2 ±2.10 29.9 ±2.28 31.1 ±3.07 30.9 ±1.54 30.7 ±2.34 31.4 ±1.90 30.4 ±1.74 31.1 ±2.17 34.1 ±1.55 33.4 ±2.74 35.6 ±3.92 34.8 ±1.79 33.6 ±3.89 35.7 ±3.09 35.1 ±1.76 36.4 ±3.11

體質(zhì)量：在試驗開始前及試驗第1 周、試驗結(jié)束時分別對小鼠體質(zhì)量進(jìn)行分析，結(jié)果見表2。各給藥組小鼠初始體質(zhì)量與空白對照組相比無顯著差異（P ＞0.05），即各組小鼠的初始體質(zhì)量較均衡；試驗第1 周及試驗結(jié)束時，各給藥組小鼠體質(zhì)量與空白對照組相比均無顯著差異（P ＞0.05）。結(jié)果表明，各受試藥物對小鼠體質(zhì)量增長無影響。

自主活動：結(jié)果見表3。給藥1 周后，與空白對照組相比，各組小鼠活動次數(shù)及站立次數(shù)均有下降，其中組方3 組小鼠活動次數(shù)與空白對照組相比下降顯著（P＝0.046）；組方1 組至組方3 組及百樂眠組小鼠站立次數(shù)與空白對照組相比下降顯著（P＝0.035，0.024，0.044，0.049）。給藥2 周后，除組方4 組外，其他各組小鼠活動次數(shù)與第1 周相比均有下降，其中組方1 組、組方3 組及百樂眠組小鼠活動次數(shù)與空白對照組相比下降顯著（P＝0.040，0.033，0.021），組方1 組至組方3 組小鼠站立次數(shù)與空白對照組相比下降顯著（P＝0.022，0.033，0.034）。給藥第1 周與第2 周，各組小鼠理毛次數(shù)與空白對照組相比均無顯著差異。

表3 各組小鼠自主活動情況比較（±s，次，n ＝10）

表3 各組小鼠自主活動情況比較（±s，次，n ＝10）

注：與空白對照組比較，▲P ＜0.05。

組方1 組組方2 組組方3 組組方4 組組方5 組組方6 組空白對照組百樂眠組第1 周47.3±18.5 46.7±25.1 42.7±30.9▲56.3±24.1 58.2±37.3 57.9±20.3 69.1±36.4 43.5±21.2第2 周41.8±20.6▲46.2±20.4 41.0±18.9▲66.9±22.8 46.8±27.0 54.3±22.5 62.2±13.5 37.9±13.4▲第1 周13.2±7.7▲12.2±13.4▲13.9±15.7▲19.7±13.8 21.0±19.2 19.4±11.5 27.6±18.5 13.5±9.0▲第2 周11.6±9.2▲12.2±12.8▲12.6±8.8▲29.0±18.3 14.9±14.8 18.0±11.2 24.8±8.1 13.5±6.6第1 周2.9±2.0 2.0±1.0 2.3±0.8 2.1±1.0 2.1±1.9 2.9±1.3 1.9±0.6 2.2±1.6第2 周1.9±1.6 1.7±1.1 2.1±1.4 2.7±1.3 2.6±1.7 2.6±1.1 2.0±0.9 1.6±1.4活動 站立 理毛組別

直接睡眠作用：各組小鼠給藥后，觀察60 min 內(nèi)小鼠活動情況，給藥組與空白對照組均無睡眠現(xiàn)象發(fā)生，小鼠活動正常，表明各藥物及百樂眠膠囊均無直接睡眠作用。

延長戊巴比妥鈉誘導(dǎo)睡眠時間：結(jié)果見表4?？梢?，與空白對照組比較，組方2 組、4 組、6 組小鼠睡眠時間相近。組方5 組小鼠睡眠時間有所延長，但無顯著差異。組方1 組、組方3 組及百樂眠組小鼠睡眠時間顯著延長（P＝0.006，0.044，0.048），表明這些提取工藝條件有助于促進(jìn)睡眠。

表4 各組小鼠延長戊巴比妥鈉誘導(dǎo)睡眠時間比較（±s，min，n ＝10）

表4 各組小鼠延長戊巴比妥鈉誘導(dǎo)睡眠時間比較（±s，min，n ＝10）

注：與空白對照組比較，▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01。

組別組方1 組組方2 組組方3 組組方4 組睡眠時間114.93±38.19▲▲60.35±25.48 100.75±44.23▲62.59±28.29組別組方5 組組方6 組空白對照組百樂眠組睡眠時間89.18 ±40.63 69.90 ±15.07 67.77 ±36.84 100.17 ±28.67▲

對戊巴比妥鈉閾下劑量催眠效果：結(jié)果見表5?？梢?，各受試藥物均可增加閾下催眠劑量戊巴比妥鈉誘導(dǎo)的小鼠睡眠只數(shù)，表明組方1 至6 提取物與戊巴比妥鈉可能產(chǎn)生協(xié)同作用。

表5 各組小鼠戊巴比妥鈉閾下劑量催眠發(fā)生率比較（%，n ＝10）

2.3 多元回歸處理與相關(guān)性分析

采用DPS 軟件處理睡眠時間，經(jīng)多元回歸得回歸方程Y＝67.29 ＋1.34X3－0.009 5X3X3＋0.005 9X1X2－0.008 8X1X3，R＝1.000 0，F(xiàn)＝4 600.345 9，回歸顯著性檢驗P＝0.011 1，表明該方程能較好地擬合各提取工藝對睡眠時間產(chǎn)生的影響。優(yōu)化結(jié)果為乙醇體積分?jǐn)?shù)0、溶劑用量10 倍、超聲時間71 min。將組方1 組至組方6組小鼠睡眠時間與干膏得率進(jìn)行Pearson 相關(guān)性分析，R＝－0.145，P＝0.785，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.4 驗證試驗

為進(jìn)一步考察優(yōu)選工藝的可靠性，按最佳提取工藝進(jìn)行驗證試驗，操作方法同前。優(yōu)化工藝連續(xù)灌胃15 d后平均延長戊巴比妥鈉誘導(dǎo)睡眠時間為（116.0±24.53）min，顯著高于空白對照組的（62.32±35.28）min與百樂眠組的（92.18±30.40）min（P＝0.000），表明其具有鎮(zhèn)靜催眠作用，且藥效顯著優(yōu)于百樂眠膠囊。驗證結(jié)果與優(yōu)選試驗結(jié)果相當(dāng)，表明該優(yōu)選工藝穩(wěn)定、可行。

3 討論

中藥復(fù)方以多成分多靶點作用于人體，各組分按一定比例組成了中藥復(fù)方的整體。在復(fù)方提取過程中，不同提取方法得到的有效成分的比例和含量各有差異，藥效差異可能較大。由于中藥復(fù)方組成復(fù)雜，藥效作用物質(zhì)基礎(chǔ)通常不明確[4－5]。目前，常見工藝參數(shù)優(yōu)化方法多以復(fù)方干膏得率或復(fù)方中單個或多個化學(xué)成分的含量為評價指標(biāo)[6－8]，但總量及個別化學(xué)成分不能代表復(fù)雜的物質(zhì)基礎(chǔ)，故往往不能客觀、全面地反映在工藝變換過程中復(fù)方功效的變化，有時化學(xué)成分含量與藥效指標(biāo)會顯示出矛盾的結(jié)果[9]。與之相比，采用藥效學(xué)指標(biāo)評價具有結(jié)果直觀的優(yōu)點。本試驗結(jié)果表明，干膏得率與藥效學(xué)指標(biāo)不相關(guān)，以干膏得率來評價工藝條件的優(yōu)劣并不適用。

酸棗仁為臨床治療失眠證常用中藥[10－12]。多項關(guān)于酸棗仁物質(zhì)基礎(chǔ)及活性的研究均證明，酸棗仁水煎液及極性較強(qiáng)部位可延長閾上劑量戊巴比妥鈉所致睡眠時間，增加閾下劑量戊巴比妥鈉所致小鼠入睡率，具有明顯的鎮(zhèn)靜催眠作用[13－15]。本試驗中以戊巴比妥鈉誘導(dǎo)小鼠睡眠時間為指標(biāo)考察酸棗仁復(fù)方提取工藝，結(jié)合工業(yè)生產(chǎn)的可行性，設(shè)計了不同醇體積分?jǐn)?shù)、溶劑用量及提取時間對提取工藝的參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，確定其最佳提取工藝為水提取。這與傳統(tǒng)提取方式一致（以水為溶劑），對生產(chǎn)設(shè)備及車間的安全要求相對較低，具有安全、無毒、生產(chǎn)成本低優(yōu)點，若后續(xù)通過樹脂分離純化活性部位，可直接提取液上樣，不需回收溶劑，樹脂使用壽命長。為更好地控制復(fù)方質(zhì)量，不同提取工藝對復(fù)方有效成分含量及其比例的影響仍有待進(jìn)一步研究。