水晶蘭苷對(duì)破骨細(xì)胞生成的抑制作用*

王宥涵，賀寶榮，2△

（1. 陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽 712046； 2. 西安交通大學(xué)附屬紅會(huì)醫(yī)院脊柱外科，陜西 西安 710054）

破骨細(xì)胞（OC）可參與骨質(zhì)疏松癥、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、骨性關(guān)節(jié)炎、脊柱椎間融合釘棒內(nèi)固定術(shù)后螺釘周圍由炎性反應(yīng)導(dǎo)致的骨溶解等多種疾病的病理進(jìn)展[1－4]，作為一類具有骨吸收功能的多核細(xì)胞，其可參與人體骨量調(diào)節(jié)。破骨細(xì)胞起源于造血系統(tǒng)中的單核巨噬細(xì)胞系，這類細(xì)胞在經(jīng)過巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M－CSF）、核因子κB 受體活化因子配體（RANKL）和一系列細(xì)胞因子的復(fù)合調(diào)節(jié)作用下，逐漸分化為具有骨吸收功能的成熟破骨細(xì)胞。活化T－細(xì)胞核因子1（NFATc1）作為破骨細(xì)胞分化過程中的主要下游靶點(diǎn)，調(diào)節(jié)多種破骨細(xì)胞特異性基因的表達(dá)，后者與破骨細(xì)胞細(xì)胞膜上的相應(yīng)受體結(jié)合，正向促進(jìn)破骨細(xì)胞的生成。GU 等[5]的研究表明，在缺乏NFATc1 的小鼠模型中常見嚴(yán)重的骨硬化表現(xiàn)。此外，NFATc1 表達(dá)水平的上調(diào)還能促進(jìn)破骨細(xì)胞的生成，并加強(qiáng)骨吸收活性。傳統(tǒng)中藥巴戟天是茜草科巴戟天屬植物巴戟天Morinda officinalis的干燥根，經(jīng)現(xiàn)代藥理學(xué)分析，其主要活性成分包括環(huán)烯醚萜類、蒽醌類和低聚糖化合物等[6]。其中，環(huán)烯醚萜類成分水晶蘭苷為巴戟天的有效成分[7]，能抑制去卵巢大鼠模型中骨量減少，其可能具有抑制破骨細(xì)胞生成的能力[8－9]。本研究中通過建立體外破骨細(xì)胞的培養(yǎng)系，觀察了水晶蘭苷抑制破骨細(xì)胞生成的作用，并通過測(cè)定水晶蘭苷對(duì)NFATc1 的表達(dá)水平，探討了可能作用的靶點(diǎn)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與細(xì)胞

儀器：IX73 型倒置顯微鏡（日本Olympus 公司）；Applied Biosystems 7500 型實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)系統(tǒng)（qPCR，美國(guó)Applied Biosystems 公司）；UV－2550型紫外分光光度計(jì)（日本Shimadzu 公司）；TGL－27M 型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（上海高致精密儀器有限公司）；BS124S 型電子分析天平（德國(guó)Sartorius 公司，精度為0.1 mg）。

試藥：水晶蘭苷（成都瑞芬思生物科技公司，純度為98.67%，批號(hào)為S－036－171216）；MTT 試劑盒（美國(guó)Sigma－Aldrich 公司，批號(hào)為M5655）；TRAP 染色盒（北京百奧萊博科技有限公司，批號(hào)為HR9064）；10% 胎牛血清（批號(hào)為10099－141），DMEM 培養(yǎng)基（批號(hào)為31600034），均購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司。

細(xì)胞：RAW264.7 細(xì)胞系（美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，ATCC，批號(hào)為ATCC.SC－6003）。

1.2 方法

細(xì)胞培養(yǎng)及分組[10－11]：A 組、B 組、C 組、D 組分別以3×105個(gè)／mL RAW264.7 細(xì)胞系接種于含有10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中，均添加35 ng／mL 的RANKL 和30 ng／mL 的M－CSF；除A 組外，B 組、C組、D 組分別添加10，20，50 μmol／L 水晶蘭苷藥液，置37 ℃及5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中，連續(xù)培養(yǎng)3 d，以上每孔設(shè)8 組平行樣。

細(xì)胞毒性檢測(cè)：采用3－（4，5－二甲基噻唑－2）－2，5－二苯基四氮唑溴鹽（MTT）比色法評(píng)估藥物的細(xì)胞毒性。取適量上述各組細(xì)胞并置96 孔板中，每孔加入MTT 溶液，孵育4 h。棄反應(yīng)液，每孔加入二甲基亞砜（DMSO），充分溶解結(jié)晶物，置分光光度計(jì)中，于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定光密度（OD值），記錄數(shù)據(jù)。

破骨細(xì)胞生成數(shù)目檢測(cè)：培養(yǎng)3 d 后，在光鏡下觀察破骨細(xì)胞生成數(shù)目，觀察到巨大空泡細(xì)胞且細(xì)胞核數(shù)目不少于3 個(gè)的細(xì)胞即為破骨細(xì)胞，加入TRAP 染色劑，置CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h，快速置光鏡下統(tǒng)計(jì)細(xì)胞核數(shù)量不少于3 個(gè)的細(xì)胞數(shù)目，并記錄數(shù)據(jù)。

破骨細(xì)胞中NFATc1 的mRNA 表達(dá)水平檢測(cè)：提取各組細(xì)胞中的RNA，置光度儀中，于260 nm 和280 nm波長(zhǎng)處測(cè)定RNA 的純度和濃度，保證比值在1.9 ～2.0間。合成cDNA 第一鏈，并進(jìn)行PCR 體外擴(kuò)增。引物序列為，NFATc1（5′－CTCGAAAGACAGCACTGGAGCAT－3′和5′－CGGCTGCCTTCCGTCTCATAG－3′），GAPDH（5′－TCAAGAAGGTGGTGAAGCAG－3′和5′－AGTGGGAGT TGCTGTTGAAGT－3′）。95 ℃失活RNase 5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸5 min，循環(huán)30 次；獨(dú)立重復(fù)3 次。

破骨細(xì)胞中NFATc1 蛋白水平表達(dá)檢測(cè)：取上述數(shù)量細(xì)胞提取總蛋白，用二喹啉甲酸（BCA）法測(cè)定蛋白濃度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）跑膠，濕轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，按說明書比例稀釋一抗并孵育過夜，隨后孵育二抗，常規(guī)顯色，置掃膜儀下測(cè)定。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析。計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA）。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

MTT 和TRAP 染色結(jié)果見表1。NFATc1 的mRNA和蛋白表達(dá)水平見圖1 和圖2。

表1 各組RAW264.7 細(xì)胞OD 值、TRAP 染色（＋）細(xì)胞數(shù)目比較（±s，n ＝8）

表1 各組RAW264.7 細(xì)胞OD 值、TRAP 染色（＋）細(xì)胞數(shù)目比較（±s，n ＝8）

注：與A 組相比，*P ＜0.05；與B 組相比，＃P ＜0.05；與C 組相比，＆P ＜0.05。

組別A 組B 組C 組D 組質(zhì)量濃度（mmol／L）0 10 20 50 OD 值1.28±0.06 1.25±0.07 1.25±0.05 1.26±0.05 TRAP 染色（＋）細(xì)胞數(shù)目（個(gè)）132.10 ±11.28 87.88 ±8.52*50.38 ±11.78*＃25.88 ±7.81*＃＆

圖1 給藥后不同濃度下NFATc1 的mRNA 表達(dá)水平

3 討論

正常骨組織的代謝是由成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成與破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收組成，生理狀態(tài)下，兩者此消彼長(zhǎng)，相互制約，最終達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡[12]。對(duì)骨質(zhì)疏松癥患者局部骨組織進(jìn)行活檢發(fā)現(xiàn)，破骨細(xì)胞較成骨細(xì)胞不僅在數(shù)目和活性上占優(yōu)勢(shì)，且明顯高于非骨質(zhì)疏松癥患者[13]。可見，破骨細(xì)胞的異常活躍與骨吸收功能亢進(jìn)是導(dǎo)致骨量丟失的重要因素。破骨細(xì)胞是許多骨丟失性疾病中重要的分子生物學(xué)基礎(chǔ)，破骨細(xì)胞的生成與骨吸收效果的體現(xiàn)是多種細(xì)胞因子復(fù)合起效的結(jié)果[14]。破骨細(xì)胞的生成需與成骨細(xì)胞相接觸，成骨細(xì)胞通過釋放M－CSF和RANKL 調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的繁殖、分化、并存[15]。RANKL可作為重要的起始因素參與到破骨細(xì)胞生成環(huán)節(jié)[16]。巴戟天主要成分水晶蘭苷具有抗氧化[17]、抗感染[18]等生物學(xué)活性，ZHANG 等[8]的研究指出，其在體內(nèi)試驗(yàn)中可降低RANKL 的表達(dá)水平，并預(yù)防去卵巢小鼠的骨丟失作用。本試驗(yàn)中通過RANKL 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞系發(fā)現(xiàn)，在無其他干預(yù)存在的空白對(duì)照組中，由RAW264.7 分化而來的破骨細(xì)胞明顯增多，而水晶蘭苷能在一定程度上減少RANKL 誘導(dǎo)產(chǎn)生的破骨細(xì)胞數(shù)目。并且結(jié)合MTT 實(shí)驗(yàn)的結(jié)果分析，水晶蘭苷對(duì)破骨細(xì)胞生成的抑制效果不是由于藥物細(xì)胞毒性而產(chǎn)生的。

圖2 給藥后不同濃度下NFATc1 的蛋白質(zhì)表達(dá)水平

OUYANG 等[19]研究指出，破骨細(xì)胞的分化經(jīng)由胞內(nèi)RANKL 介導(dǎo)信號(hào)通路，該通路的中下游信號(hào)點(diǎn)位包含了腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF6）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）、激活蛋白1（AP－1）、核因子κB（NF－κB）等，刺激信號(hào)經(jīng)瀑布級(jí)聯(lián)的方式傳導(dǎo)至NFATc1 這一終末靶點(diǎn)。由NFATc1 激活的破骨細(xì)胞能大量正反饋調(diào)節(jié)如NF－κB、TRAP、組織蛋白酶（CTSK）、基質(zhì)金屬蛋白酶－9（MMP－9）、破骨細(xì)胞相關(guān)受體（OSCAR）、樹突狀細(xì)胞－特異性跨膜蛋白（DCSTAMP）、ATP 酶VO 結(jié)構(gòu)域d2 亞型（atpv0d2）和原癌基因（c－Src）及其底物酪氨酸激酶底物5／5 個(gè)SH3 結(jié)構(gòu)域（TKS5／FISH）等破骨細(xì)胞相關(guān)的分化、功能因子[20]?？梢姡琋FATc1 對(duì)于破骨細(xì)胞的活性有重要的調(diào)節(jié)作用[21]。本試驗(yàn)中通過RANKL 誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞系發(fā)現(xiàn)，給予一定濃度的水晶蘭苷后，在限定濃度范圍內(nèi)，隨著水晶蘭苷藥物濃度的升高，mRNA 表達(dá)水平逐漸降低，且在WB 試驗(yàn)中也觀察到NFATc1 的蛋白表達(dá)量隨著藥物濃度升高而逐漸降低。結(jié)合TRAP 染色結(jié)果分析，NFATc1 表達(dá)水平的下降可能與水晶蘭苷抑制破骨細(xì)胞分化生成有關(guān)。

綜上所述，有關(guān)水晶蘭苷對(duì)破骨細(xì)胞生成的調(diào)節(jié)作用雖在分子生物學(xué)層面有一定的進(jìn)展，但本試驗(yàn)中暴露出的問題也應(yīng)引起注意。目前體外試驗(yàn)顯示，水晶蘭苷對(duì)破骨細(xì)胞的分化具有抑制作用，仍缺乏水晶蘭苷在體內(nèi)試驗(yàn)中抑制破骨細(xì)胞活性的直接證據(jù)。故仍需進(jìn)行更細(xì)致和系統(tǒng)的試驗(yàn)設(shè)計(jì)。另外，鑒于破骨細(xì)胞特異性基因的種類繁多，且調(diào)控機(jī)制也較復(fù)雜，關(guān)于NFATc1 介導(dǎo)的破骨細(xì)胞特異性產(chǎn)物是如何調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞生成的，仍有待進(jìn)一步探究。