新型冠狀病毒滅活方式對高效液相色譜法監(jiān)測萬古霉素血藥濃度的影響

張曉旭，侯林中，姜 暉，張倩影，繳萬里，劉曉紅△

（1. 河北省唐山市工人醫(yī)院藥學(xué)部，河北 唐山 063000； 2. 河北省唐山中心醫(yī)院藥學(xué)部，河北 唐山 063000；3. 華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院藥學(xué)部，河北 唐山 063000）

新型冠狀病毒肺炎（COVID－19）疫情自2019年12月暴發(fā)以來迅速蔓延至全球，截至2020年3月24日，全球COVID－19 患者已逾37 萬例[1]。新型冠狀病毒（SARS－CoV－2）為β 屬冠狀病毒，顆粒呈圓形或橢圓形并有包膜，其與蝙蝠嚴(yán)重急性呼吸綜合征（SARS）樣冠狀病毒（bat－SL－CoVZC45）同源性超過85%[2]；對紫外線和熱敏感，56 ℃30 min、乙醚、75%乙醇、含氯消毒劑、過氧乙酸和氯仿等脂溶劑可有效滅活病毒[3]。

現(xiàn)有數(shù)據(jù)基本證實，SARS－CoV－2 可經(jīng)呼吸道飛沫、消化道和接觸傳播，且有傳染性，COVID－19 臨床表現(xiàn)多樣，病情反復(fù)多變[4]。COVID－19 目前以對癥治療為主，沒有特效藥[3]。COVID－19 重型患者一般較輕型患者合并更多基礎(chǔ)疾病，同時可能合并細(xì)菌、真菌感染，用藥方案復(fù)雜，應(yīng)通過治療藥物監(jiān)測（TDM）優(yōu)化用藥[5]。COVID－19 重癥患者的治療方案中，糖肽類抗菌藥物萬古霉素為常用藥，相關(guān)指南建議需監(jiān)測其血藥濃度[6]。萬古霉素血藥濃度的監(jiān)測方法有微生物法、酶放大免疫法（EMIT）、熒光偏振免疫法，以及更常用、專屬性強、準(zhǔn)確度高及成本低的高效液相色譜（HPLC）法[7]。

對于SARS－CoV－2 的滅活方式，TDM 標(biāo)本可考慮采用56 ℃30 min 水浴加熱樣本，亦可考慮采用短波紫外線處理樣本進(jìn)一步保證病毒滅活效果[8]。前期研究顯示，經(jīng)水浴56 ℃加熱30 min 處理后，不會影響免疫法監(jiān)測萬古霉素的血藥濃度[8]，但濕熱滅活及紫外滅活對HPLC 法監(jiān)測萬古霉素血藥濃度的影響尚未見研究報道。本研究中考察了SARS－CoV－2 不同滅活方式對HPLC 法監(jiān)測萬古霉素血藥濃度的影響?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

1200 型高效液相色譜儀，包括G1329A 型自動進(jìn)樣器、G1311A 型四元泵、G1315D 型二極管陣列檢測器和G1316A 型柱溫箱（美國Agilent 公司）。萬古霉素對照品（中國食品藥品檢定研究院，含量100%，批號130360－200301）；甲醇為色譜純，其余試劑為分析純，水為實驗室自制超純水。健康人血清（唐山市工人醫(yī)院檢驗科提供）。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent TC － C18柱（150 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動相：0.2% 三乙胺緩沖液（磷酸調(diào)pH 至3.2） －甲醇（15 ∶85，V／ V）；流速：1.2 mL／min；檢測波長：236 nm；柱溫：40 ℃。外標(biāo)法計算得萬古霉素血藥濃度。

1.2.2 樣品采集與制備

血樣：選取唐山市定點醫(yī)院—— 唐山市傳染病醫(yī)院收治的COVID－19 患者2 例（患者1，男，64 歲；患者2，女，67 歲），靜脈滴注萬古霉素（12 h 1 g，8 h 0.7 g），直至其達(dá)穩(wěn)態(tài)血藥濃度（半衰期約6 h，至少4 個固定劑量）[9]。下次給藥前30 min 內(nèi)抽取患者靜脈血3 ～5 mL，置紅帽頭普通采血管中，3 500 r ／ min 離心10 min，吸取血清300 μL（空白人血清270 μL ＋萬古霉素質(zhì)控液30 μL），加入沉淀劑10%高氯酸100 μL，渦旋振蕩2 min，15 000 r／min 離心10 min，吸取上清液50 μL。

質(zhì)控液：稱取萬古霉素對照品11.60 mg，精密稱定，置10 mL 容量瓶中，超純水溶解并定容至刻度，制成質(zhì)量濃度為1.16 mg／mL 的萬古霉素貯備液，再經(jīng)稀釋，得質(zhì)量濃度分別為7.25 mg／L 和29.00 mg／L 的萬古霉素質(zhì)控液Q2 和Q1。

1.2.3 血藥濃度監(jiān)測

56 ℃水?。夯颊呓o藥前30 min 同時抽取血樣，置2 個紅帽頭普通采血管內(nèi)，分別于56 ℃水浴加熱樣本0 min 和30 min 后測定。

紫外照射：取質(zhì)控液（Q2 和Q1）和血樣（血樣1 和血樣2），分別紫外照射0，30，60 min 后測定。

2 結(jié)果

2.1 水浴后血藥濃度

2份血樣56 ℃水浴加熱0 min 和30 min 后檢測，萬古霉素血藥濃度均無明顯變化。詳見表1。

2.2 紫外照射后血藥濃度

質(zhì)控液和血樣紫外照射0，30，60 min 后檢測，萬古霉素降解，且隨照射時間的增長，降解率成倍增長。詳見表2。

表1 血樣56 ℃水浴加熱后萬古霉素血藥濃度監(jiān)測結(jié)果（mg／L）

表2 紫外照射后質(zhì)控液及血樣萬古霉素監(jiān)測結(jié)果

2.3 紫外照射后萬古霉素HPLC 圖

結(jié)果見圖1。

3 討論

對于用于TDM 的樣本，應(yīng)考慮在不影響檢測的前提下滅活病毒。可對COVID－19 患者血樣進(jìn)行56 ℃水浴加熱30 min 處理，或于短波紫外條件下靜置30 min，以保證病毒滅活。

有研究表明，萬古霉素的穩(wěn)定性不高，常溫放置即可觀察到顏色逐漸變紅，可能是其分子結(jié)構(gòu)中存在酚基及二酚基，酚類的水溶液遇光易水合或氧化成醌而呈粉紅色[10]。萬古霉素監(jiān)測血樣處理前4 ℃保存1 周，能保持相對穩(wěn)定，處理后8 h 內(nèi)能保持相對穩(wěn)定，但處理后48 h 則開始出現(xiàn)降解[11]。

本研究結(jié)果顯示，經(jīng)56 ℃水浴加熱30 min 處理后，不影響萬古霉素血藥濃度監(jiān)測結(jié)果。因此，可采用濕熱法56 ℃水浴30 min 滅活病毒后，以HPLC 法監(jiān)測COVID－19 患者的萬古霉素血藥濃度。

對于TDM 樣本，也可在短波紫外條件下靜置30 min，進(jìn)一步保證病毒滅活。由于SARS－CoV－2 也可能通過氣溶膠傳播，故前處理操作盡可能在生物安全柜里完成，試驗前后采用紫外線消毒30 ～60 min[9]。前期試驗研究未提到萬古霉素質(zhì)控液[12]、萬古霉素監(jiān)測樣品（血樣、腦脊液和關(guān)節(jié)液）[13 －15]需遮光保存，更未考察紫外照射對萬古霉素血藥濃度監(jiān)測的影響。但同時發(fā)現(xiàn)，萬古霉素質(zhì)控液雖未遮光，但保存于4 ℃冰箱、6 個月內(nèi)未有明顯降解。

本研究結(jié)果顯示，紫外照射極大地加快了萬古霉素的降解。可能是由于萬古霉素質(zhì)控液存放于透明離心管內(nèi)，而血樣存放多了采血管帽頭與標(biāo)簽的遮擋，故降解率不同。但即使有遮擋，血樣暴露于紫外條件下，萬古霉素的降解仍對監(jiān)測結(jié)果有較大影響，故采用HPLC 法監(jiān)測COVID－19 患者萬古霉素血藥濃度時，不可用短波紫外滅活樣本病毒。同時，萬古霉素血樣、質(zhì)控液在接受標(biāo)本時（傳遞窗等地方）及生物安全柜內(nèi)處理過程中常可能暴露于紫外線下，故應(yīng)注意萬古霉素質(zhì)控液與血樣均要避免紫外照射。

圖1 萬古霉素血藥濃度高效液相色譜圖

綜上所述，HPLC 法監(jiān)測COVID－19 患者萬古霉素血藥濃度，可用濕熱法56 ℃水浴30 min 滅活樣本SARS－CoV－2，不可用紫外滅活方式，且萬古霉素質(zhì)控液與血樣均要注意避免紫外照射。