轉(zhuǎn)氨基作用與氨基酸紙層析實(shí)驗(yàn)的改進(jìn)*

游云悠，魏友煜，左 越，黎威巍，羅麗丹，金科華**

(1.湖北科技學(xué)院醫(yī)藥研究院，湖北 咸寧 437100；2.湖北科技學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院)

轉(zhuǎn)氨基作用與氨基酸紙層析是一個(gè)重要的綜合性生化實(shí)驗(yàn)，現(xiàn)有的各大高校實(shí)驗(yàn)教程只有簡(jiǎn)單的操作流程，缺乏創(chuàng)新。筆者在做該實(shí)驗(yàn)時(shí)思考了以下問(wèn)題：可否用其他緩沖液代替磷酸緩沖液？轉(zhuǎn)氨基時(shí)間能否縮短？當(dāng)小白鼠數(shù)量不夠時(shí)，肝勻漿可否稀釋使用？未用完的肝勻漿保存一段時(shí)間是否還有活性？添加輔酶-磷酸吡哆醛(pyridoxal phosphate，PP)能否加快轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)？通過(guò)回答這些問(wèn)題，我們改進(jìn)了轉(zhuǎn)氨基作用與氨基酸紙層析的方式方法，極大提高了實(shí)驗(yàn)效率，現(xiàn)與同行分享。

1 材料與方法

1.1 試劑

磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀為天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品，磷酸氫二鈉為天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品，Tris購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司，氫氧化鈉為國(guó)藥集團(tuán)產(chǎn)品，巴比妥鈉為天津市紅巖化學(xué)試劑廠產(chǎn)品，丙氨酸為上海如吉生物科技有限公司產(chǎn)品，α-酮戊二酸、谷氨酸、PP購(gòu)自阿拉丁集團(tuán)，茚三酮為無(wú)錫市展望化工試劑有限公司產(chǎn)品，以上試劑均為分析純。雙圈牌濾紙為杭州沃華化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。

按劉漢才等[1]的方法配制0.01mol/L pH 7.4的四種緩沖液：Tris-HCl緩沖液(緩沖液1)，磷酸緩沖液(緩沖液2)，磷酸二氫鉀-氫氧化鈉緩沖液(緩沖液3)，巴比妥鈉-HCl緩沖液(緩沖液4)。再用每種緩沖液分別配制濃度均為0.1mol/L丙氨酸、α-酮戊二酸和谷氨酸，用NaOH將三者的pH調(diào)至7.4。

飽和PP溶液的配制：取10mg PP，加1mL緩沖液2，室溫渦旋振蕩5min，室溫5000r/min離心5min，取上清小份分裝，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 制備肝勻漿

脫臼處死小白鼠，取出肝臟，剪碎，按每0.9g肝重加4mL緩沖液的比例，研磨勻漿，室溫12000r/min離心2min，取上清小份分裝，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)

向1.5mL離心管中加入丙氨酸、α-酮戊二酸、肝勻漿各100μL，37℃水浴預(yù)定時(shí)間，100℃加熱10min，終止反應(yīng)。

1.2.3 層析

點(diǎn)樣：取直徑11cm圓形濾紙，通過(guò)圓心作直徑將圓等分，取轉(zhuǎn)氨基后的上清液0.5μL點(diǎn)樣[2]，取稀釋6倍的丙氨酸和谷氨酸0.5μL點(diǎn)樣。在濾紙圓心打一直徑約7mm的小孔，插入燈芯。展層：將0.05%的茚三酮溶液(溶于75%的乙醇)[3-4]倒入直徑10cm的玻璃培養(yǎng)皿中，將濾紙平放在培養(yǎng)皿上，燈芯浸入層析液中，培養(yǎng)皿蓋蓋在濾紙上，層析至溶劑前緣距濾紙邊緣約1cm時(shí)取出濾紙[5]，用吹風(fēng)機(jī)吹干顯色，至氨基酸斑點(diǎn)顏色不再加深。所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。

1.2.4 緩沖液類型對(duì)轉(zhuǎn)氨基的影響

分別用緩沖液1、2、3、4制備的肝勻漿與同種緩沖液配制的丙氨酸和谷氨酸混合，37℃反應(yīng)1h，比較轉(zhuǎn)氨基結(jié)果。

1.2.5 轉(zhuǎn)氨基時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)氨基的影響

用緩沖液2配制的肝勻漿與底物混合，分別反應(yīng)10、20、40、80min，比較轉(zhuǎn)氨基結(jié)果。

1.2.6 肝勻漿濃度對(duì)轉(zhuǎn)氨基的影響

將緩沖液2制備的肝勻漿用緩沖液2分別稀釋2、5、10倍，取不同濃度的肝勻漿分別與底物反應(yīng)20min，比較轉(zhuǎn)氨基結(jié)果。

1.2.7 肝勻漿保存時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)氨基的影響

將緩沖液2制備的肝勻漿于4℃分別保存2、4、8d，分別與底物反應(yīng)20min，比較轉(zhuǎn)氨基結(jié)果[6]。

1.2.8 PP對(duì)轉(zhuǎn)氨基的影響

PP是轉(zhuǎn)氨酶的輔酶，有研究發(fā)現(xiàn)PP能提高血清ALT的活性[7-8]。血清中ALT是肝臟合成的，PP是否會(huì)激活肝勻漿中ALT的活性？為論證這個(gè)假設(shè)，我們向轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)體系中加入不同濃度的PP，比較轉(zhuǎn)氨基結(jié)果。

取實(shí)驗(yàn)步驟1.2.6稀釋5、10倍的肝勻漿實(shí)驗(yàn)。處理組1(或2)反應(yīng)體系為：稀釋5(或10)倍的肝勻漿100μL，95μL丙氨酸，95μL谷氨酸，10μL飽和的PP。對(duì)照組除10μL緩沖液2代替飽和PP外，其余成分與處理組相同?；靹蚋鞒煞?，37℃水浴10min，比較轉(zhuǎn)氨基結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 緩沖液種類不影響轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)

緩沖液1、2、3、4制備的肝勻漿進(jìn)行轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)，均出現(xiàn)丙氨酸和谷氨酸兩個(gè)斑點(diǎn)(圖1，封二)，且兩個(gè)斑點(diǎn)的顏色深淺和大小接近，表明緩沖液種類不影響轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)。

2.2 轉(zhuǎn)氨基時(shí)間可適當(dāng)縮短

不稀釋的肝勻漿轉(zhuǎn)氨基10、20、40、80min結(jié)果如圖2(封二)。由圖可見(jiàn)，反應(yīng)10min時(shí)轉(zhuǎn)氨基作用尚未完全，反應(yīng)20min以上均出現(xiàn)丙氨酸和谷氨基酸兩個(gè)斑點(diǎn)，谷氨酸斑點(diǎn)的顏色不再加深。由此，轉(zhuǎn)氨基時(shí)間可以縮短至20min，節(jié)約時(shí)間。

2.3 肝勻漿可適當(dāng)稀釋使用

稀釋的肝勻漿轉(zhuǎn)氨基結(jié)果如圖3(封二)，可見(jiàn)將肝勻漿稀釋2、5倍后仍出現(xiàn)兩個(gè)氨基酸斑點(diǎn)，稀釋10倍后轉(zhuǎn)氨基速度下降，生成的谷氨酸較少，谷氨酸斑點(diǎn)較淡。以上結(jié)果表明適度稀釋的肝勻漿仍能進(jìn)行轉(zhuǎn)氨基作用。故實(shí)驗(yàn)教學(xué)時(shí)，可適當(dāng)稀釋肝勻漿，提高利用率。

2.4 肝勻漿保存時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)

保存不同時(shí)間的肝勻漿轉(zhuǎn)氨基結(jié)果見(jiàn)圖4(封二)，隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，谷氨酸斑點(diǎn)逐漸變淡，表明轉(zhuǎn)氨基作用逐漸減弱，故進(jìn)行轉(zhuǎn)氨基實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)盡量用新鮮的肝勻漿。

2.5 PP對(duì)轉(zhuǎn)氨基無(wú)影響

PP對(duì)轉(zhuǎn)氨基的影響見(jiàn)圖5(封二)，由圖可知無(wú)論是否加入PP，轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)均能正常進(jìn)行，表明PP對(duì)本實(shí)驗(yàn)無(wú)影響。

3 討 論

本研究改進(jìn)轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)的方式和方法。①在離心管中進(jìn)行轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)教程的轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)均在試管中進(jìn)行，弊端較多。首先試劑利用率低。用于層析點(diǎn)樣的反應(yīng)液只需幾微升，而試管內(nèi)反應(yīng)液有幾毫升，浪費(fèi)太多。其次，由于反應(yīng)液多，升降溫慢，實(shí)驗(yàn)效率低。再次，不便于點(diǎn)樣。點(diǎn)樣的毛細(xì)管(10cm長(zhǎng))比試管(15cm長(zhǎng))短很多，必須將試管內(nèi)的反應(yīng)液傾斜至管口才能被毛細(xì)管吸取，操作極為不便。在1.5mL離心管中轉(zhuǎn)氨基的3個(gè)優(yōu)點(diǎn)：一是所用試劑減少至原來(lái)的十分之一，極大提高了試劑利用率；二是縮短試劑升降溫時(shí)間；三是方便點(diǎn)樣。②將丙氨酸和谷氨酸稀釋后點(diǎn)樣。轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)體系中丙氨酸、α-酮戊二酸、肝勻漿等體積混合，故丙氨酸加入到緩沖體系后被稀釋了3倍。轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)可逆，平衡常數(shù)為1.0[9]，即約一半的丙氨酸轉(zhuǎn)化為谷氨酸。綜上，反應(yīng)完成后，丙氨酸與加入前相比共稀釋了6倍，故將用于參照的丙氨酸和谷氨酸稀釋6倍再點(diǎn)樣，使二者的濃度與轉(zhuǎn)氨基后剩余的丙氨酸和生成的谷氨酸濃度相近，從而保證顯色后的斑點(diǎn)大小和顏色相似，便于對(duì)比遷移率。幾乎所有的實(shí)驗(yàn)教程中，反應(yīng)前后的氨基酸都點(diǎn)相同體積，導(dǎo)致未轉(zhuǎn)氨基的丙氨酸和谷氨酸斑點(diǎn)遠(yuǎn)大于轉(zhuǎn)氨基的，顯色后的氨基酸斑點(diǎn)大小相差懸殊。③用移液器點(diǎn)樣。實(shí)驗(yàn)教程中強(qiáng)調(diào)點(diǎn)樣要適當(dāng)，但幾乎所有的教程都用毛細(xì)管點(diǎn)樣，點(diǎn)樣量與毛細(xì)管在濾紙上的停留時(shí)間有關(guān)。由于停留時(shí)間難以控制，以致無(wú)法控制點(diǎn)樣量，致使點(diǎn)樣成敗靠運(yùn)氣，點(diǎn)樣適當(dāng)?shù)囊髱熒鶡o(wú)法企及。用移液器點(diǎn)樣可以精確控制點(diǎn)樣量，確保顯色后色斑大小相近、適宜。

本研究獲得多了項(xiàng)創(chuàng)新成果：①不同緩沖液配制的肝勻漿對(duì)轉(zhuǎn)氨基無(wú)影響。pH相同的不同種類的緩沖液對(duì)ALT的活性無(wú)影響，故實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)現(xiàn)有試劑靈活配置緩沖液。②轉(zhuǎn)氨基時(shí)間可適當(dāng)縮短。未稀釋的肝勻漿轉(zhuǎn)氨基20min，反應(yīng)即達(dá)平衡點(diǎn)，故用未稀釋的肝勻漿進(jìn)行轉(zhuǎn)氨基時(shí)，可將轉(zhuǎn)氨基的時(shí)間縮短一半，以節(jié)省實(shí)驗(yàn)時(shí)間。③肝勻漿可適當(dāng)稀釋使用。肝勻漿稀釋5倍以內(nèi)時(shí)，對(duì)轉(zhuǎn)氨基影響不大；稀釋過(guò)度時(shí)導(dǎo)致轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)不完全。故可將肝勻漿進(jìn)行適當(dāng)稀釋，以提高肝勻漿的利用率。④肝勻漿可低溫適當(dāng)保存。4℃保存2d以內(nèi)，ALT活性降幅較小，對(duì)轉(zhuǎn)氨基影響不大。但隨著保存時(shí)間延長(zhǎng)，ALT活性降幅增大。⑤PP對(duì)肝勻漿中的ALT無(wú)激活作用。添加PP未加快轉(zhuǎn)氨基作用，說(shuō)明肝臟中ALT均已結(jié)合PP，無(wú)需額外添加，或者脫輔酶-PP的ALT極少，在本研究條件下，未觀察到PP對(duì)ALT的激活作用。

本研究通過(guò)改進(jìn)轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)的方式方法，極大提高了實(shí)驗(yàn)的效率，值得在實(shí)驗(yàn)教學(xué)中推廣。