miR-103在急性缺血性腦卒中患者藥物療效及預(yù)后評估中的價(jià)值

李瑋桓 張麗 劉牧

近年來，急性缺血性腦卒中(acute ischemic stroke，AIS)發(fā)病率逐年升高，且其發(fā)病有年輕化趨勢[1-2]。AIS發(fā)病主要由腦血管阻塞所致，造成大腦局灶性神經(jīng)功能缺損，甚至腦組織死亡[3]。目前，臨床多采用營養(yǎng)神經(jīng)及改善微循環(huán)等藥物治療AIS，并取得一定成效。但在AIS治療療效評估上仍存在一定不足，如僅通過觀察AIS患者癥狀及體征評價(jià)療效時(shí)，難免存在因標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一等問題而使療效的判斷結(jié)果存在差異，且重復(fù)性較差[4]。準(zhǔn)確判斷AIS患者療效對于后續(xù)治療及預(yù)后均較為重要。既往研究結(jié)果顯示，微RNA-103(microRNA-103，miR-103)在大腦中動脈梗死大鼠模型血管新生及腦保護(hù)方面有一定調(diào)節(jié)作用[5]。此外，miR-103還被證實(shí)可通過靶向調(diào)控Piezo1蛋白來調(diào)節(jié)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞毛細(xì)管的形成及細(xì)胞活力[6]，亦可通過調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷促進(jìn)動脈粥樣硬化進(jìn)展[7]。推測miR-103在AIS患者中亦具有促進(jìn)血管新生、調(diào)節(jié)腦細(xì)胞活力的功能，可能成為AIS治療過程中病情及預(yù)后的生物標(biāo)志物。本研究初步探討了miR-103在AIS患者療效評價(jià)及預(yù)后評估中的價(jià)值，旨在為AIS的治療療效及預(yù)后判斷提供參考。

1 對象和方法

1.1 對象收集2016年3月至2019年2月華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院收治的AIS患者106例，其中男72例，女34例，年齡29～76歲，平均(56.27±7.27)歲。患者均符合《中國急性缺血性腦卒中診治指南2014》[8]診斷標(biāo)準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)CT/MRI檢查排除腦出血；(2)單側(cè)肢體或面部麻木、無力，或出現(xiàn)語言障礙等；(3)首次發(fā)病；(4)簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)患有精神疾病或認(rèn)知功能障礙性疾病等；(2)肝、腎功能異常；(3)凝血功能異常；(4)住院治療期間死亡；(5)預(yù)后隨訪失聯(lián)；(6)合并惡性腫瘤。本研究經(jīng)華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)通過。

1.2 方法

1.2.1臨床資料收集：收集患者年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)、吸煙史、收縮壓、舒張壓、空腹血糖(fasting plasma glucose，F(xiàn)PG)、總膽固醇(cholesterol total，TC)、三酰甘油(triacylglycerol，TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表評分(National Institutes of Health Stroke scale，NIHSS)及發(fā)病-治療時(shí)間等資料。

1.2.2血清miR-103水平檢測[9]：抽取患者治療前以及治療1、3、7、14 d晨起肘靜脈血，以3500 r/min離心15 min(離心半徑為8 cm)，提取上清液，放置于-20℃冰箱待測。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測血清miR-103水平。取上清液加至總RNA提取試劑盒(日本TaKaRa公司)，提取總RNA，并用紫外分光光度計(jì)檢測其純度。取2 μg總RNA置于miRNA專用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa公司)中，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA；最后，用SLAN96S型PCR擴(kuò)增儀(上海宏石公司)進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為94℃ 10 min，94℃ 45 s，60℃ 45 s，72℃ 45 s，40個(gè)循環(huán)。參考GenBank數(shù)據(jù)庫中公布的基因序列。Homo sapiens microRNA miR-103 gene，complete sequence(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AF480501.1)，序列：5′-AGCAGCATTGTACAGGGCTATGA-3′。Rattus norvegicus microRNA 103a-1 (Mir103a1)，microRNA(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NR_031861.1)，序列：5′-GTACAGGGCTATGAAGGCATTGAGAC-3′。通過比對基因序列，具有同源性。本試驗(yàn)所用引物序列參照文獻(xiàn)[5]。miR-103正向：5′-TGATGCTGGTGCTAGAAGT-3′，反向：5′-TCTCCACAGAACAGGCAAG-3′；內(nèi)參U6正向：5′-CTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，反向：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。用 2-ΔΔCt表示miR-103水平。

1.2.3治療及療效評價(jià)[10]：參照《中國急性缺血性腦卒中診治指南2014》[8]中有關(guān)AIS治療方案進(jìn)行治療。給予患者營養(yǎng)神經(jīng)(依達(dá)拉奉)和改善微循環(huán)(丁苯酞)治療，同時(shí)根據(jù)病情給予如吸氧、抗血小板聚集、降壓、降脂及降糖等對癥處理。療效評價(jià)[10]：根據(jù)AIS患者治療前和治療14 d時(shí)NIHSS評分變化評價(jià)治療療效。治愈：NIHSS評分降低>90%；顯效：45%

1.2.4隨訪及預(yù)后評價(jià)[11]：于患者出院后1周開始隨訪，每個(gè)月隨訪1次，了解患者出院后恢復(fù)情況，隨訪開始時(shí)間為2016-3-30，截至2019-5-28。預(yù)后評價(jià)：根據(jù)AIS患者治療前后NIHSS評分變化及90 d后改良Rankin量表(mRS)評分評價(jià)預(yù)后。AIS患者治療后NIHSS評分降低，且mRS評分≤2分，則預(yù)后良好；反之，則預(yù)后不良。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，服從正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組均數(shù)間比較采用重復(fù)測量的方差分析，兩兩比較采用配對樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)；采用受試者工作特征(ROC)曲線評價(jià)miR-103判斷AIS治療效果的效能；將單因素分析中P≤0.10的因素納入Logistic回歸方程，分析影響AIS患者預(yù)后的因素。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同療效患者臨床特征比較經(jīng)治療，AIS患者中治愈9例(8.49%)，顯效49例(46.23%)，有效21例(19.81%)，無效27例(25.47%)。有效組TC水平低于無效組(P<0.05)，而年齡、性別構(gòu)成、BMI、吸煙史等臨床特征比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見表1。

2.2 兩組血清miR-103水平變化兩組治療前后血清miR-103水平變化均存在時(shí)間效應(yīng)(均P<0.05)，血清miR-103水平均呈先升高后降低變化(均P<0.05)。有效組治療3、7、14 d血清miR-103水平均低于無效組(均P<0.01)。結(jié)果見表2。此外，有效組患者血清miR-103水平降低幅度(治療前與治療14 d時(shí)miR-103差值)大于無效組(1.14±0.43比0.88±0.52；t=2.541，P<0.05)。

2.3 miR-103評價(jià)AIS治療效果的價(jià)值結(jié)果見表3，圖1。以AIS患者治療前后NIHSS評分變化作為評價(jià)治療療效的金標(biāo)準(zhǔn)。治療7 d miR-103水平評價(jià)AIS療效的ROC曲線下面積(AUC)為0.875，高于治療前及治療1、3、14 d時(shí)間點(diǎn)(Z=5.135，P<0.01；Z=4.303，P<0.01；Z=1.968，P<0.05；Z=1.683，P>0.05)。

表1 兩組AIS患者臨床資料比較

注：AIS：急性缺血性腦卒中，表2～5同。BMI：體重指數(shù)，TG：三酰甘油，LDL-C：低密度脂蛋白膽固醇，HDL-C：高密度脂蛋白膽固醇；表4同。FPG：空腹血糖，TC：總膽固醇，NIHSS：美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表評分；表4～5同

表2 兩組AIS患者血清miR-103水平比較

注：與組內(nèi)前一時(shí)間點(diǎn)比較，aP<0.05

表3 AIS患者治療不同時(shí)間檢測miR-103水平評價(jià)療效的ROC結(jié)果

注：AUC：曲線下面積

圖1 不同時(shí)間點(diǎn)檢測miR-103評價(jià)AIS患者治療效果的ROC曲線

2.4 不同預(yù)后AIS患者基線資料比較預(yù)后良好組74例，不良組32例。預(yù)后良好組年齡、FPG、TC、NIHSS評分、治療14 d后miR-103水平均低于不良組，發(fā)病-治療時(shí)間短于不良組(均P<0.05)，而性別構(gòu)成、BMI、吸煙、收縮壓等余指標(biāo)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。具體結(jié)果見表4。

2.5 多因素Logistics回歸分析影響AIS預(yù)后的因素以年齡、FPG、TC、NIHSS評分、發(fā)病-治療時(shí)間及miR-103(治療14 d后miR-103評價(jià)AIS患者預(yù)后的AUC最大，因此此處為治療14 d后miR-103)評價(jià)AIS患者預(yù)后的最佳截?cái)帱c(diǎn)為界，將其轉(zhuǎn)換為二分類變量。將年齡(≤57歲=0，>57歲=1)、FPG(≤7.36 mmol/L=0，>7.36 mmol/L=1)、TC(≤4.04 mmol/L=0，>4.04 mmol/L=1)、NIHSS評分(≤11分=0，>11分=1)、發(fā)病-治療時(shí)間(≤3.27 h=0，>3.27 h=1)及miR-103(≤1.29=0，>1.29=1)作為自變量，將AIS患者預(yù)后(預(yù)后不良=0，預(yù)后良好=1)作為因變量納入Logistic回歸分析，結(jié)果顯示FPG、NIHSS評分、發(fā)病-治療時(shí)間及miR-103水平均與AIS患者預(yù)后相關(guān)(表5)。

3 討論

AIS起病較急，多數(shù)患者病情均較為嚴(yán)重，常伴有不同嚴(yán)重程度的并發(fā)癥，如運(yùn)動、語言等神經(jīng)功能障礙[12]。MiRNA是一類由20～25個(gè)核苷酸組成的非編碼RNA，在細(xì)胞增殖、分化及凋亡等過程均發(fā)揮著重要作用[13]。

本研究發(fā)現(xiàn)，不同療效患者治療初期血清miR-103水平均有一定程度升高，隨治療時(shí)間延長其水平下降，但有效組治療14 d后血清miR-103水平降低更為明顯，推測兩組患者治療前期血清miR-103水平升高可能與急性發(fā)病有關(guān)，miR-103水平可能與AIS患者治療療效存在一定關(guān)系。采用ROC曲線分析結(jié)果顯示，治療7 d血清miR-103在判斷AIS患者療效的價(jià)值最高，其原因可能為治療7 d后，患者病情趨于穩(wěn)定，此時(shí)血清miR-103水平能夠較好地反映治療期間藥物的療效。進(jìn)一步分析不同預(yù)后AIS患者的miR-103水平，結(jié)果顯示預(yù)后良好組血清miR-103水平低于預(yù)后不良組，提示miR-103可能反映AIS患者預(yù)后，有望成為AIS預(yù)后評估的生物標(biāo)志物。多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示FPG、NIHSS評分及發(fā)病-治療時(shí)間均與AIS患者預(yù)后密切相關(guān)，這與既往研究結(jié)果一致[14-16]。同時(shí)，本研究還發(fā)現(xiàn)血清miR-103水平也與AIS患者預(yù)后密切相關(guān)。

表4 不同預(yù)后AIS患者臨床資料比較

表5 影響AIS患者預(yù)后因素的Logistics回歸分析結(jié)果

miR-103在哺乳動物多數(shù)組織中均有表達(dá)，在腦組織中其表達(dá)水平較高，可調(diào)控人大腦皮質(zhì)中腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)的表達(dá)。BDNF是神經(jīng)營養(yǎng)因子的一員，在促進(jìn)腦神經(jīng)細(xì)胞存活、生長及分化中發(fā)揮重要作用[17-18]。從幼兒階段至成年早期過程中，大腦皮質(zhì)中BDNF水平不斷升高，并在成年后維持一定水平，隨著大腦皮質(zhì)的老化，其水平逐漸降低。在上述病理生理過程中，miR-103作為抑制因子可下調(diào)大腦皮質(zhì)中BDNF水平。此外，抑制miR-103表達(dá)還可靶向作用于管內(nèi)皮生長因子進(jìn)而促進(jìn)缺血性中風(fēng)大鼠腦血管生成[5]。近年來，亦有研究發(fā)現(xiàn)抑制miR-103表達(dá)可阻斷張力蛋白同源基因介導(dǎo)的絲裂原活化蛋白激酶信號傳導(dǎo)通路，進(jìn)而抑制動脈粥樣硬化所產(chǎn)生的炎癥及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[19]。當(dāng)缺血性中風(fēng)發(fā)生時(shí)，伴隨大量炎性細(xì)胞因子釋放及氧化應(yīng)激損傷，機(jī)體會下調(diào)miR-103水平，并可能通過調(diào)節(jié)BDNF、血管內(nèi)皮生長因子水平及張力蛋白同源基因介導(dǎo)的絲裂原活化蛋白激酶信號傳導(dǎo)通路保護(hù)腦神經(jīng)細(xì)胞。AIS治療藥物可降低患者炎性細(xì)胞因子及氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)水平，miR-103水平可能與炎性細(xì)胞因子及氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)水平存在一定關(guān)聯(lián)，進(jìn)而反映AIS患者治療療效及預(yù)后。

綜上所述，本文研究結(jié)果顯示，miR-103與AIS患者治療療效及預(yù)后均存在一定關(guān)系，治療7 d miR-103水平在評價(jià)AIS患者療效中具有較高價(jià)值，而治療14 d miR-103水平判斷預(yù)后方面具有較高價(jià)值。本研究為單中心研究，樣本量較小，關(guān)于miR-103與AIS治療療效及預(yù)后的確切關(guān)系尚需深入研究。