糞菌移植對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎小鼠腸道功能及細(xì)胞因子的影響

王志豪 李作孝

多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)作為一種具有致殘性的中樞神經(jīng)系統(tǒng)慢性脫髓鞘疾病，其病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，可能與病毒感染、自身免疫反應(yīng)、遺傳因素、環(huán)境因素有關(guān)。近年來研究發(fā)現(xiàn)，腸道微生態(tài)改變，特別是腸道菌群紊亂、失調(diào)與潰瘍性結(jié)腸炎、肝硬化、MS、系統(tǒng)性自身免疫性疾病等多種疾病有關(guān)[1]。腸道與大腦之間存在微生物-腸-腦軸(microbiota-gut-brain axis)，腸道菌群可通過此軸調(diào)控中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育與功能。實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)是目前研究MS最常用的動(dòng)物模型，Cekanaviciute等[2]研究發(fā)現(xiàn)，與健康受試者糞便定植的小鼠相比，用MS患者衍生的糞便定植的無菌小鼠會(huì)出現(xiàn)更嚴(yán)重的EAE癥狀。糞菌移植(fecal microbiota transplantation，F(xiàn)MT)是一種重塑腸道正常菌群的方法，通過改變腸道微生物的數(shù)量、結(jié)構(gòu)、類型以及對(duì)機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)，對(duì)腸道和非腸道疾病發(fā)揮一定治療作用[3]。本研究通過觀察FMT對(duì)EAE小鼠發(fā)病及腸道功能和細(xì)胞因子的影響，旨在探討FMT對(duì)EAE小鼠發(fā)病的防治作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用6～8周齡清潔級(jí)SPF級(jí)C57BL/6雌性小鼠30只，體重18～22 g，購于北京斯貝福生物技術(shù)有限公司〔許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0002〕。將小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、EAE模型組、FMT干預(yù)組，每組10只。所有小鼠飼養(yǎng)于西南醫(yī)科大學(xué)忠山校區(qū)清潔級(jí)動(dòng)物房內(nèi)，自由進(jìn)食及飲用無菌蒸餾水，室溫(24±2)℃，12 h明暗交替，實(shí)驗(yàn)過程符合《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)和使用條例》，且經(jīng)西南醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物保護(hù)與使用機(jī)構(gòu)委員會(huì)批準(zhǔn)通過。

1.2 主要試劑包括髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白肽35-55(MOG35-55，上海吉爾生化有限公司)，完全福氏佐劑、百日咳毒素(美國Sigma公司)，卡介苗凍干粉 (上海瑞楚生物科技有限公司)，雙歧桿菌、乳桿菌、腸球菌培養(yǎng)基(北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司)，梭菌、擬桿菌培養(yǎng)基(青島海博生物技術(shù)有限公司)，腸桿菌培養(yǎng)基(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司)，真桿菌培養(yǎng)基(卡邁舒上海生物科技有限公司)，酵母菌培養(yǎng)基(北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院)及小鼠白細(xì)胞介素1β(IL-1β)、IL-6、腫瘤壞死因子α(TNF-α)ELISA試劑盒(武漢科鹿生物科技有限責(zé)任公司)。

1.3 方法

1.3.1糞便濾液制備[4-5]：(1)收集糞便：于早晨8：00采用肛門刺激法促使正常對(duì)照組小鼠排便，收集每只小鼠新鮮成型糞便2粒，共20?；靹?，稱取5 g糞便。(2)糞便混懸液的制備：將小鼠糞便按質(zhì)量1∶10溶解于無離子水中，置于攪拌器中進(jìn)行攪拌，取混懸液。(3)過濾：用雙層無菌紗布過濾，收集懸液。(4)離心：混懸液以6000 r/min離心20 min(離心半徑=10 cm)。(5)重懸：離心后棄掉上清，將沉淀懸浮于50 mL生理鹽水，上下顛倒混勻，即為糞便濾液。糞便濾液當(dāng)天制備當(dāng)天使用。

1.3.2EAE模型制備：造模前各組小鼠均禁食、禁飲24 h，將MOG35-55溶于PBS液中，稀釋為3 mg/mL，卡介苗溶于完全福氏佐劑中，濃度為10 g/L。將上述2種液體按體積1∶1混勻后于冰上持續(xù)抽打乳化至油包水狀態(tài)。用1 mL注射器于小鼠背部皮下注射誘導(dǎo)乳化劑0.2 mL(脊柱兩側(cè)任選4點(diǎn)各0.05 mL)，于造模當(dāng)天及2 d后，給予小鼠腹腔注射百日咳菌稀釋液0.5 mL，制備EAE模型。正常對(duì)照組以同樣方式注射等量生理鹽水。造模后根據(jù)行為學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分，≥2分即為發(fā)病，表示造模成功[6]。FMT干預(yù)組于造模第2天起給予當(dāng)天制備的新鮮糞便濾液0.4 mL灌胃，1次/d，共14 d。正常對(duì)照組、EAE模型組小鼠按相同方案給予等量生理鹽水灌胃。收集EAE模型組和FMT干預(yù)組小鼠發(fā)病高峰期(神經(jīng)功能評(píng)分連續(xù)3 d無變化)成型糞便(2粒/只)，立即至于液氮中并隨即轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存。正常對(duì)照組小鼠于28 d后以同樣方法收集糞便。處死各組小鼠后取尾靜脈血和腦組織進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3小鼠發(fā)病情況觀察：造模當(dāng)天起每天早上8：00對(duì)各組小鼠發(fā)病情況進(jìn)行觀察，確定小鼠發(fā)病潛伏期及達(dá)高峰期時(shí)間，并根據(jù)Kono等[7]5分評(píng)分法進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分：0分為不發(fā)病，1分為尾巴無力，2分為輕微后肢無力，3分為嚴(yán)重后肢麻痹，4分為四肢麻痹，5分為瀕死或死亡。

1.3.4腸道菌群檢測：檢測時(shí)取各組每只小鼠凍存糞便0.5 g，分別加入稀釋液進(jìn)行連續(xù)稀釋(10-2～10-7)，取20 μL稀釋菌液接種于腸桿菌、腸球菌、酵母菌、擬桿菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌、真桿菌及梭菌的選擇性培養(yǎng)基上。前3種為需氧菌，置于37 ℃普通培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，其余為厭氧菌，置于厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。采用日本光岡腸道菌群分析法進(jìn)行定性定量檢測，以API生化鑒定系統(tǒng)的厭氧菌三級(jí)鑒定法鑒定菌種，鑒定細(xì)菌至屬水平，計(jì)數(shù)并記錄每個(gè)平板上的菌落數(shù)，求出各平板平均菌落數(shù)，并算出平板菌落總數(shù)，取均值后計(jì)算原始樣品每克中的菌落數(shù)，最終結(jié)果以每克濕糞的菌落形成單位(colony forming unit，CFU)的對(duì)數(shù)值表示。采用B/E值反映腸道的功能狀況，其≥1表示腸道定植抗力正常，≤1表示腸道定植抗力降低，菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生紊亂。

1.3.5IL-1β、IL-6、TNF-α檢測：取各組小鼠尾靜脈血、腦組織檢測IL-1β、IL-6、TNF-α水平，具體操作步驟按ELISA試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法；計(jì)數(shù)資料比較采用卡方檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠發(fā)病情況正常對(duì)照組小鼠未見發(fā)病。EAE模型組和FMT干預(yù)組小鼠均出現(xiàn)不同嚴(yán)重程度發(fā)病，表現(xiàn)為精神萎靡、毛發(fā)光澤度降低、脫毛、食欲下降、體重減輕，癥狀逐漸加重出現(xiàn)尾部下垂，步態(tài)不穩(wěn)，后肢行走無力，甚至癱瘓。各組小鼠均未出現(xiàn)死亡。FMT干預(yù)組發(fā)病潛伏期、達(dá)高峰期時(shí)間較EAE模型組延長(P<0.05)，神經(jīng)功能評(píng)分較EAE模型組降低(P<0.05)。結(jié)果見表1。

表1 兩組小鼠發(fā)病潛伏期、達(dá)高峰期時(shí)間、高峰期神經(jīng)功能評(píng)分比較

注：EAE：實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎，F(xiàn)MT：糞菌移植；表2～3同

2.2 各組小鼠腸道菌群值與B/E值比較與正常對(duì)照組比較，EAE模型組擬桿菌數(shù)量及B/E值降低(P<0.05)；與EAE模型組比較，F(xiàn)MT干預(yù)組腸桿菌數(shù)量減少，雙歧桿菌數(shù)量及B/E值增加(均P<0.05)。結(jié)果見表2。

2.3 各組小鼠血清、腦組織IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)與正常對(duì)照組比較，EAE模型組小鼠血清及腦組織IL-1β、IL-6、TNF-α水平增高，而FMT干預(yù)組其水平較EAE模型組減低(均P<0.05)。結(jié)果見表3。

表2 各組小鼠腸道菌群值及B/E值比較 濕糞)

注：CFU：菌落形成單位；與正常對(duì)照組比較，aP<0.05；與EAE模型組比較，bP<0.05

表3 各組小鼠血清及腦組織IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較

注：IL-1β：白細(xì)胞介素1β；IL-6：白細(xì)胞介素6；TNF-α：腫瘤壞死因子α；與正常對(duì)照組比較，aP<0.05；與EAE模型組比較，bP<0.05

3 討論

腸道微生物作為一種新的環(huán)境危險(xiǎn)因素，在免疫介導(dǎo)的疾病(如MS)中引起了極大關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)腸道菌群失調(diào)、腸功能紊亂在MS發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮一定作用。

人體正常狀態(tài)下腸道菌群相對(duì)平衡且穩(wěn)定，當(dāng)環(huán)境變化、飲食改變、腸道感染及損傷、情緒變化、藥物刺激等相關(guān)因素影響下將引起腸道菌群失調(diào)，導(dǎo)致有益菌群減少、有害菌群增殖，引起腸道黏膜的損傷，誘發(fā)一系列炎癥及免疫反應(yīng)導(dǎo)致免疫功能紊亂，最終參與MS的發(fā)病和進(jìn)展過程。本研究結(jié)果顯示EAE模型組擬桿菌數(shù)量較正常對(duì)照組減少，B/E值<1，與既往研究結(jié)果基本一致。擬桿菌正常情況下寄居于人和動(dòng)物的腸道、上呼吸道和生殖道，長期應(yīng)用廣譜抗生素、激素、免疫抑制劑等情況可導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)或免疫功能紊亂從而引發(fā)內(nèi)源性感染[8]。B/E值反映腸道定植抗力、腸道功能狀況，腸道定植抗力對(duì)機(jī)體免疫力具有重要影響，其水平下降可增加消化道感染、免疫功能紊亂風(fēng)險(xiǎn)[9]。

目前調(diào)節(jié)腸道菌群的方法有FMT、益生菌、益生元、抗生素等，因FMT具有高安全性和較好療效故而應(yīng)用頗為廣泛，在自身免疫性腸炎、乙肝、慢性非酒精性肝硬化、自閉癥、MS等腸內(nèi)腸外疾病的治療中發(fā)揮重要作用[10]。FMT能增加腸道有益菌群比例和菌群多樣性，維持腸道微環(huán)境穩(wěn)態(tài)，并參與菌群與宿主之間的信號(hào)交換[11-12]。腸道中的有益菌群如乳桿菌、雙歧桿菌可以降低腸道pH值，加強(qiáng)腸道上皮緊密連接，參與腸道生物學(xué)屏障、機(jī)械屏障的組成，避免腸道致病菌的入侵、生長，減少炎性介質(zhì)的釋放，調(diào)節(jié)腸道免疫功能，進(jìn)而減輕腸道炎癥反應(yīng)[13-15]。此外，研究表明FMT可通過改變神經(jīng)遞質(zhì)、血管活性物質(zhì)、能量代謝，改善腸道炎癥反應(yīng)，重建腸道菌群對(duì)疾病發(fā)揮治療作用[16]。目前有關(guān)FMT在MS中的研究及應(yīng)用較少。Borody等[17]評(píng)估了FMT對(duì)3例MS患者便秘的療效發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)MT可改善患者胃動(dòng)力，同時(shí)對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)狀況和泌尿功能亦有改善作用。國外一項(xiàng)針對(duì)FMT對(duì)MS患者干預(yù)的前瞻性研究正在進(jìn)行，最終研究結(jié)果尚未公布。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)MT干預(yù)組小鼠B/E值>1，并高于EAE模型組，提示FMT能改善EAE模型小鼠腸道菌群失衡，提高腸道定植抗力。由此可見，F(xiàn)MT在MS研究領(lǐng)域中可能具有一定價(jià)值。

生理?xiàng)l件下，腸道微生物群表達(dá)的微生物相關(guān)分子，能激活免疫細(xì)胞表面的識(shí)別受體，誘導(dǎo)抗炎介質(zhì)的分泌，促進(jìn)腸神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和功能完善，有助于維持腸道免疫耐受[18]。同時(shí)也能促進(jìn)機(jī)體免疫系統(tǒng)的成熟，通過調(diào)節(jié)固有免疫和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)來對(duì)抗炎癥、免疫介導(dǎo)的疾病等[19]。病理狀態(tài)下，腸道微生物發(fā)生組成、結(jié)構(gòu)、數(shù)量紊亂，調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞之間的連接緊密性降低，增加腸道的通透性，使腸道屏障功能降低。當(dāng)腸道微生物組紊亂或腸黏膜屏障破壞時(shí)，微生物相關(guān)分子刺激巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子，激活適應(yīng)性免疫細(xì)胞，導(dǎo)致免疫穩(wěn)態(tài)破壞，進(jìn)而改變血-腦屏障的完整性和功能，觸發(fā)自身免疫脫髓鞘，并直接與中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的不同類型細(xì)胞產(chǎn)生相互作用[20]。細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α是自身免疫性疾病、炎癥疾病所共有的促炎因子，參與了EAE、潰瘍性結(jié)腸炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病的病理過程[21-22]。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)MT可延長EAE小鼠發(fā)病潛伏期、達(dá)高峰期時(shí)間，臨床癥狀減輕，神經(jīng)功能評(píng)分降低，F(xiàn)MT干預(yù)組血清、腦組織IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)均低于EAE模型組，提示FMT可改善EAE小鼠腸道菌群紊亂，減輕EAE小鼠炎性反應(yīng)，進(jìn)而改善EAE癥狀，對(duì)EAE有一定治療作用，有望為臨床應(yīng)用FMT治療MS提供新的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)MT可延緩EAE小鼠發(fā)病潛伏期和發(fā)病達(dá)高峰時(shí)間，降低神經(jīng)功能評(píng)分，調(diào)節(jié)腸道菌群，減低炎性因子水平。由于本研究未對(duì)FMT的最佳使用時(shí)間、劑量頻次、實(shí)施途徑以及其調(diào)控機(jī)制等進(jìn)行探討，因此FMT對(duì)MS的確切療效尚需進(jìn)一步研究。