復(fù)合酶制備魚(yú)蒸煮液水解肽及其抗氧化活性研究

林煌華,謝友坪,馬瑞娟,石新國(guó),劉樂(lè)冕,陳劍鋒

(1.福建省海產(chǎn)品廢棄物綜合利用工程技術(shù)研究中心,福州大學(xué),福建福州 350108; 2.福州市海產(chǎn)品高值化利用行業(yè)技術(shù)創(chuàng)新中心,福州大學(xué),福建福州 350108)

鳀魚(yú)(Engraulisjaponicus)是一種生活在溫帶海洋中上層的小型魚(yú)類,多分布在我國(guó)東海、黃海和渤海,主要產(chǎn)地在閩浙二省。鳀魚(yú)肉質(zhì)細(xì)嫩且營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高,其中蛋白含量高達(dá)15%～20%[1],含有人體需要的各種氨基酸,尤其賴氨酸含量較高[2-3]。鳀魚(yú)的脂肪含量在6%左右,其中二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)含量分別占總鳀魚(yú)油的9.12%和11.89%[4]。此外,鳀魚(yú)還含有多種維生素、微量元素和益生菌[5-6]。鳀魚(yú)常被加工成魚(yú)干、魚(yú)松、魚(yú)片、魚(yú)露、魚(yú)醬油等休閑食品和調(diào)味品[7],通過(guò)精深加工還可以將其制成魚(yú)油等[8]生物保健品。研究表明,鳀魚(yú)生物制品不但營(yíng)養(yǎng)豐富,還具有降血糖、調(diào)血脂等功效[9-10]。

由于鳀魚(yú)的內(nèi)源性酶活力較強(qiáng),魚(yú)體容易變質(zhì),在捕撈之后需要盡快加工。蒸煮壓榨是鳀魚(yú)加工的關(guān)鍵步驟之一,在蒸煮過(guò)程中會(huì)有大量蛋白質(zhì)、游離氨基酸、多肽、風(fēng)味物質(zhì)和微量元素等物質(zhì)溶解在蒸煮液中,使得蒸煮液營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高。但是,由于海上加工技術(shù)和空間的限制,目前這些蒸煮液大都被直接排放,造成一定程度的資源浪費(fèi)[5]。同時(shí),由于蒸煮液的生物耗氧量(BOD)和化學(xué)耗氧量(COD)較高,其排放將嚴(yán)重污染海洋生態(tài)環(huán)境[11]。因此,合理利用鳀魚(yú)蒸煮液對(duì)提高海洋資源利用率以及減少環(huán)境污染具有重要意義。林云等[12]以鯖魚(yú)罐頭蒸煮液為原料,采用生物酶解法獲取的生物活性肽能夠抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)的活性并具有較高的抗氧化性。有研究報(bào)道,通過(guò)添加外源蛋白酶從低值魚(yú)中制備多肽,得到的多肽氨基酸組成平衡且必須氨基酸含量高,可用作保健食品的原料[13-15]。楊帆等[16]采用胰蛋白酶酶解制備孔鰩軟骨蛋白寡肽,結(jié)果顯示制備的多肽具有較強(qiáng)的抗氧化性。生物酶解法制備蛋白多肽是目前最有效的手段[17],研究證實(shí),利用復(fù)合酶水解蛋白可提高水解度,從而得到更多的小分子多肽[18]。因此,對(duì)鳀魚(yú)蒸煮液中的蛋白進(jìn)行回收,并進(jìn)一步通過(guò)復(fù)合酶解法制備生物活性肽,可提高鳀魚(yú)資源的綜合利用效率。

本研究以鳀魚(yú)蒸煮液作為原料,旨在通過(guò)外源酶酶解技術(shù)制備水解肽,在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上運(yùn)用中心組合設(shè)計(jì)法優(yōu)化復(fù)合酶酶解工藝,并對(duì)制備獲得的水解肽抗氧化活性進(jìn)行研究,該實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為進(jìn)一步促進(jìn)鳀魚(yú)資源的高值化綜合利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鳀魚(yú)蒸煮液 福州海匯生物科技實(shí)業(yè)有限公司;堿性蛋白酶(200000 U/g) 北京索萊寶科技有限公司;胰蛋白酶(50000 U/g) 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;木瓜蛋白酶(800000 U/g) 上海源葉生物科技有限公司;中性蛋白酶(60000 U/g) 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;細(xì)胞色素C、抑酞酶、桿菌酶、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸、馬尿酸 美國(guó)Sigma-Aldrich公司;乙腈、甲醇 色譜純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;三氟乙酸、鹽酸、氫氧化鈉、三氯乙酸 分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

UV-1700紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本島津公司;Sartorius BS 210S電子天平 德國(guó)Sartorius公司;高效液相色譜儀 日本島津公司;TGL-15B高速臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;電熱鼓風(fēng)干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司;循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 廣東深圳國(guó)華電器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 鳀魚(yú)蒸煮液制備水解肽的單因素實(shí)驗(yàn) 前期實(shí)驗(yàn)表明,堿性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶對(duì)鳀魚(yú)蒸煮液的酶解效果較好,同時(shí)在酶添加量為500 U/g(E/S),蒸煮液蛋白濃度為100 g/L時(shí),酶解效果最佳,基于此,本研究考察不同復(fù)合酶組合(堿性蛋白酶+木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶+胰蛋白酶、堿性蛋白酶+中性蛋白酶、木瓜蛋白酶+胰蛋白酶、木瓜蛋白酶+中性蛋白酶、胰蛋白酶+中性蛋白酶)、酶解溫度(37.5、47.5、57.5、67.5、77.5 ℃)、酶解pH(4.5、5.5、6.5、7.5、8.5、9.5、10.5)、酶解時(shí)間(0、5、15、30、45、60、90 min)、復(fù)合酶比例(3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3)對(duì)酶解液三氯乙酸氮溶解指數(shù)(Trichloroacetic acid-nitrogen soluble index,TCA-NSI值)的影響,確定最適的單因素條件。制備鳀魚(yú)蒸煮液水解肽的酶解單因素實(shí)驗(yàn)的基本條件為:底物濃度100 g/L、溫度57.5 ℃、酶解時(shí)間1 h、pH7.5、復(fù)合酶比例1∶1。單因素實(shí)驗(yàn)中,改變其中一個(gè)因素,固定其他條件,以分析各單因素對(duì)TCA-NSI得率的影響。

1.2.2 鳀魚(yú)蒸煮液制備水解肽的響應(yīng)面試驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,利用Design-Expert 8.0.6,根據(jù)Box-Benhnken中心組合設(shè)計(jì)原理,將溫度、pH、復(fù)合酶比例(質(zhì)量比)這3個(gè)影響因素作為試驗(yàn)因素,以TCA-NSI為響應(yīng)值,設(shè)計(jì)三因素三水平的正交分析試驗(yàn),試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)的因素和水平Table 1 Factors and levels of response surface test

1.2.3 TCA-NSI的測(cè)定 TCA-NSI為酶解液經(jīng)過(guò)三氯乙酸(TCA)沉淀后的氮溶解指數(shù),可反映蛋白質(zhì)的酶解效率。TCA-NSI的測(cè)定參考鄭志強(qiáng)[19]報(bào)道的方法。

式(1)

1.2.4 蛋白質(zhì)濃度測(cè)定 蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定參照潘風(fēng)光等[20]的雙縮脲法。

1.2.5 多肽分布測(cè)定 采用高效液相色譜法進(jìn)行測(cè)定,具體參照GB/T 22729-2008。

1.2.6 鳀魚(yú)蒸煮液蛋白肽的體外抗氧化試驗(yàn)

1.2.6.1 羥自由基清除率的測(cè)定 羥自由基清除率的測(cè)定參照王爽等[21]的方法,并略作修改。在試管中依次加入0.1 mL不同質(zhì)量濃度的酶解液、0.4 mL 8.8 mmol/L H2O2、0.4 mL 9 mmol/L FeSO4、0.4 mL 9 mmol/L水楊酸(無(wú)水乙醇配制)以及5 mL去離子水,37 ℃反應(yīng)30 min,于510 nm處測(cè)定吸光值A(chǔ)1。未加酶解液的溶液的吸光度以A0表示;以相同體積的蒸餾水代替酶解液設(shè)置為空白組,其吸光度以A2表示。以抗壞血酸為陽(yáng)性對(duì)照。

式(2)

1.2.6.2 DPPH自由基清除率的測(cè)定 DPPH自由基清除率的測(cè)定參考Morales等[22]的方法,并略作修改。在試管中依次加入4.0 mL DPPH乙醇溶液(0.1 mmol/L)和0.2 mL不同濃度的酶解液,混勻。室溫靜置暗反應(yīng)30 min,測(cè)定517 nm處吸收值A(chǔ)1。以相同體積的乙醇代替樣品作為空白組,其吸光值以A0表示。以抗壞血酸為陽(yáng)性對(duì)照。

式(3)

1.2.6.3 超氧陰離子自由基清除率的測(cè)定 超氧陰離子自由基清除率的測(cè)定參考王艷梅等[23]的鄰苯三酚自氧化法,并略作修改。將1.0 mL不同濃度的酶解液與1.8 mL 50 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.2)混勻,室溫靜置10 min,加入0.1 mL 10 mmol/L鄰苯三酚(溶于10 mmol/L HCl),于320 nm處測(cè)定吸光值,每隔30 s讀數(shù)一次,讀數(shù)時(shí)間為4 min,斜率設(shè)定為鄰苯三酚自氧化速率(ΔA)。實(shí)驗(yàn)組的鄰苯三酚自氧化速率以ΔA1表示;以1.0 mL雙蒸水代替樣品的空白組的鄰苯三酚自氧化速率以ΔA0表示。以抗壞血酸為陽(yáng)性對(duì)照。

式(4)

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次,結(jié)果取平均值,實(shí)驗(yàn)結(jié)果由平均值±SD表示。采用單因素方差分析(one-way ANOVA)的鄧肯法(Duncan’s test)分析數(shù)據(jù)之間的顯著性(IBM SPSS Statistics 24.0軟件),P<0.05表示數(shù)據(jù)之間具有顯著性差異。采用Origin 8.5軟件作圖,Design-Expert 8.0軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 蛋白酶的選擇 由圖1可知,不同復(fù)合酶組成(質(zhì)量比1∶1)對(duì)醍魚(yú)蒸煮液的酶解效果具有較為明顯的差異。堿性蛋白酶與中性蛋白酶的組合對(duì)醍魚(yú)蒸煮液的水解能力最強(qiáng),TCA-NSI可達(dá)73.65%,而木瓜蛋白酶與中性蛋白酶的水解效果最差。由于堿性蛋白酶和中性蛋白酶的催化基團(tuán)分別是絲氨酸和甘氨酸[24],且鳀魚(yú)蒸煮液中甘氨酸和絲氨酸含量高于其他氨基酸[25],因此堿性蛋白酶和中性蛋白酶的酶解效果優(yōu)于其他復(fù)合酶。綜合考慮,選取堿性蛋白酶和中性蛋白酶組成的復(fù)合酶進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 不同復(fù)合酶對(duì)TCA-NSI的影響Fig.1 Effect of different complex enzymes on TCA-NSI注:堿:堿性蛋白酶,木:木瓜蛋白酶,胰:胰蛋白酶,中:中性蛋白酶;不同小寫(xiě)字母表示差異顯著,圖2～圖5同。

2.1.2 酶解溫度對(duì)TCA-NSI的影響 由圖2可知,當(dāng)溫度小于57.5 ℃時(shí),隨著溫度的上升,酶解反應(yīng)加快,TCA-NSI提高;溫度超過(guò)57.5 ℃時(shí),TCA-NSI則呈下降趨勢(shì)。在一定范圍內(nèi),升溫可增加酶的溶解度及酶分子的擴(kuò)散速度,但過(guò)高溫度會(huì)破壞蛋白酶空間結(jié)構(gòu),引起不可逆失活。有研究表明該復(fù)合酶在54 ℃的條件下酶解綠豆蛋白效果最佳[26],這可能是由于底物的不同造成最適酶解溫度存在差異。綜合考慮,復(fù)合酶的酶解溫度應(yīng)選擇57.5 ℃。

圖2 酶解溫度對(duì)TCA-NSI的影響Fig.2 Effect of hydrolysis temperature on TCA-NSI

2.1.3 pH對(duì)TCA-NSI的影響 酸堿環(huán)境會(huì)改變酶的空間構(gòu)型,影響底物與酶的解離狀態(tài),進(jìn)而影響水解程度。由圖3可知,隨著pH的升高,TCA-NSI呈現(xiàn)先增后緩慢下降的趨勢(shì),在pH為8.5時(shí)TCA-NSI最高,為77.55%。有研究表明該復(fù)合酶在pH8.5時(shí)對(duì)綠豆分離蛋白的水解度最高,這與本研究的結(jié)果相似[26]。因此,選取pH8.5為最佳酶解pH。

圖3 pH對(duì)TCA-NSI的影響Fig.3 Effect of pH on TCA-NSI

2.1.4 酶解時(shí)間對(duì)TCA-NSI影響 由圖4可知,在反應(yīng)初期,隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng),TCA-NSI迅速增加;當(dāng)酶解時(shí)間超過(guò)45 min后TCA-NSI呈現(xiàn)平穩(wěn)趨勢(shì),即TCA-NSI在45、60和90 min無(wú)顯著性差異(P>0.05)。為節(jié)省制備時(shí)間,選取45 min為最佳酶解時(shí)間。

圖4 酶解時(shí)間對(duì)TCA-NSI的影響Fig.4 Effect of hydrolysis time on TCA-NSI

2.1.5 不同復(fù)合酶比例對(duì)TCA-NSI的影響 由圖5可知,當(dāng)堿性蛋白酶與中性蛋白酶的比例為2∶1、1∶1和1∶2時(shí)TCA-NSI無(wú)顯著差異(P>0.05),分別是76.25%、73.39%和74.43%,而當(dāng)比例為1∶3和3∶1時(shí)TCA-NSI較低。根據(jù)以上結(jié)果,可選擇復(fù)合酶比例為2∶1、1∶1和1∶2進(jìn)行后續(xù)研究。

圖5 不同復(fù)合酶比例對(duì)TCA-NSI的影響Fig.5 Effect of different ratio ofcomplex enzymes on TCA-NSI

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示,利用Design-Expert 8.0.6將相應(yīng)的TCA-NSI與各因素進(jìn)行回歸擬合后,得到溫度(A)、酶解pH(B)、復(fù)合酶比例(C)對(duì)TCA-NSI的最佳回歸方程為:Y=77.63-3.64A-2.54B-3.70C-0.52AB+0.26AC+1.43BC-17.01A2-10.12B2-5.95C2,R2=0.9993。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Design and results of response surface experiment

2.2.2 響應(yīng)面分析 由圖6b、6d、6f可知,在這3組交互作用中,BC(pH和復(fù)合酶比例)交互作用最強(qiáng),其次是AB(溫度和pH)的交互作用,而AC(溫度和復(fù)合酶比例)的交互作用最弱,這與表3顯著性檢驗(yàn)得到的結(jié)果一致。由圖6a、6c、6e所示的響應(yīng)圖可知,3個(gè)因素與TCA-NSI呈拋物線關(guān)系,即隨著各因素值的增加,TCA-NSI先增加后減小。

表3 回歸方程各項(xiàng)系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)和變異數(shù)分析Table 3 Significance test and analysis of variance coefficients of regression equation

圖6 溫度、pH和復(fù)合酶比例兩兩交互對(duì)TCA-NSI影響的響應(yīng)面圖和等高線Fig.6 Response surface plots and contour plots of interactive effect of temperature,pH and the ratio of complex enzymes on TCA-NSI

2.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果及回歸模型驗(yàn)證 由Design-Expert軟件得到酶解鳀魚(yú)蒸煮液的最佳工藝條件為溫度54.49 ℃、pH8.18、堿性蛋白酶與中性蛋白酶的比例1.32∶1。為驗(yàn)證模型的可信度,以及考慮實(shí)際操作的方便性,對(duì)得到的最優(yōu)工藝進(jìn)行調(diào)整,將驗(yàn)證工藝設(shè)計(jì)為:溫度54.50 ℃、pH為8.20、復(fù)合酶比例1∶1,重復(fù)驗(yàn)證3次,響應(yīng)面預(yù)測(cè)得到的TCA-NSI為78.32%,而驗(yàn)證結(jié)果為76.51%,與預(yù)測(cè)值相近,表明該回歸模型能較好地預(yù)測(cè)鳀魚(yú)蒸煮液的酶解情況。

2.3 酶解液中蛋白肽的分子量測(cè)定

從表4可知,鳀魚(yú)蒸煮液中蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量分布主要集中在大于10000 Da的區(qū)域(51.046%),而經(jīng)過(guò)酶解后得到由10～40個(gè)氨基酸組成的中長(zhǎng)肽鏈(相對(duì)分子質(zhì)量在1500～5000 Da)占10.043%,由2～10個(gè)氨基酸組成的小肽鏈(相對(duì)分子質(zhì)量在180～1500 Da)占81.941%,而游離氨基酸占7.336%。這與顧林等[13]研究利用蛋白酶水解魚(yú)粉蒸煮液得到80%以上的短肽(10肽以下)的結(jié)果相似。由此可知,該復(fù)合酶可有效將鳀魚(yú)蒸煮液中的大分子量蛋白質(zhì)水解成小分子多肽,這為通過(guò)鳀魚(yú)蒸煮液生產(chǎn)功能性食品提供了理論依據(jù)。

表4 酶解液與蒸煮液分子量分布Table 4 Molecular weight distribution ofenzymatic hydrolysate and anchovy cooking liquid

2.4 鳀魚(yú)蒸煮液水解肽的體外抗氧化試驗(yàn)

不同質(zhì)量濃度的酶解液和抗壞血酸對(duì)DPPH自由基、超氧陰離子自由基、羥自由基的清除率隨著質(zhì)量濃度的增大而顯著增加,呈現(xiàn)出一定的劑量依賴效應(yīng)(圖7),該結(jié)論與石斑魚(yú)肉水解肽的自由基清除能力與溶液濃度呈正相關(guān)性的結(jié)果一致[27]。計(jì)算得到蛋白肽對(duì)DPPH自由基、羥自由基、超氧陰離子自由基清除率的IC50分別為(2.45±1.03)、(1.37±1.01)和(3.45±1.01) mg/mL?？箟难釋?duì)上述自由基的清除率分別為(0.06±0.01)、(0.90±0.02)和(0.39±0.02) mg/mL,說(shuō)明蛋白肽的抗氧化性弱于抗壞血酸,這可能是因?yàn)轺桇~(yú)蒸煮液的酶解產(chǎn)物是混合物,有些多肽的抗氧化性較弱,拮抗作用抑制了活性。但是,一般認(rèn)為某種物質(zhì)的IC50低于10 mg/mL時(shí),說(shuō)明其具有良好的抗氧化性[28]。因此,本研究制備的鳀魚(yú)蒸煮液水解肽具有較強(qiáng)的體外抗氧化活性。

圖7 不同濃度水解肽和抗壞血酸對(duì)自由基清除率的影響Fig.7 Effect of different concentrations of hydrolyzed peptidesand ascorbic acid on free radical scavenging rate注:(a)羥自由基清除率;(b)DPPH自由基清除率;(c)超氧陰離子自由基清除率。

3 結(jié)論

本文優(yōu)化了復(fù)合酶法酶解鳀魚(yú)蒸煮液以獲得水解肽的研究方法,并對(duì)水解肽的抗氧化活性進(jìn)行研究。篩選出制備鳀魚(yú)蒸煮液水解肽的較適用復(fù)合酶為堿性蛋白酶和中性蛋白酶。復(fù)合酶制備鳀魚(yú)蒸煮液水解肽的最佳工藝條件為:酶解時(shí)間45 min、酶解溫度54.5 ℃、酶解pH8.2、堿性蛋白酶與中性蛋白酶比例1∶1,在此條件下TCA-NSI可達(dá)76.51%。鳀魚(yú)蒸煮液水解肽中分子量低于1500 Da的小肽占81.941%,而且水解肽具有較強(qiáng)的體外抗氧化活性。本研究的結(jié)果表明采用復(fù)合酶法可以高效酶解鳀魚(yú)蒸煮液,酶解產(chǎn)物可用于開(kāi)發(fā)活性肽產(chǎn)品。