副溶血性弧菌毒性相關(guān)因子及其外分泌蛋白的研究進展

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(1.徐州工程學(xué)院食品(生物)工程學(xué)院,江蘇徐州 221018; 2.徐州工程學(xué)院江蘇省食品資源開發(fā)與質(zhì)量安全重點建設(shè)實驗室,江蘇徐州 221018; 3.山東省棗莊市市中區(qū)環(huán)保局環(huán)境監(jiān)測站,山東棗莊 277100)

副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)隸屬于γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria),弧菌目(Vibrionales),弧菌屬(Vibrio),是一種無芽孢的嗜鹽嗜堿性的革蘭氏陰性短桿狀細菌。1950年,日本大阪發(fā)生了一起由沙丁魚引發(fā)的爆發(fā)性食物中毒事件,造成了272人感染腹瀉疾病,20人死亡,這是世界首次對V.parahaemolyticus引發(fā)的食物中毒事件的報道[1]。自此之后,該細菌引發(fā)的食物中毒事件陸續(xù)被報道,現(xiàn)已成為世界范圍內(nèi)重要的食源性致病菌。V.parahaemolyticus廣泛存在于近海的海水、海底沉積物和魚、蝦、貝殼等海產(chǎn)品中,例如,牡蠣、鮑魚、海魚、海蝦、海蟹、海蜇等。除海產(chǎn)品外,淡水魚、咸菜、畜禽肉、蛋品等食品中均檢測到V.parahaemolyticus[2]。該菌在環(huán)境中的分布與溫度和鹽度息息相關(guān),夏秋季為其引發(fā)食物中毒的高發(fā)季節(jié)。生態(tài)學(xué)研究表明,V.parahaemolyticus冬季主要存在于海底沉積物中,晚春或初夏時分,當(dāng)水溫上升到14 ℃以上時,該菌會由沉積物釋放到水體環(huán)境中[3]。低溫水域新鮮捕獲的海產(chǎn)品中,V.parahaemolyticus的密度通常低于103cfu/g,而在溫度偏高的水域中,海產(chǎn)品中該菌的密度則高于103cfu/g,若未經(jīng)冷藏,該菌在24 h內(nèi)會呈現(xiàn)50～790倍的增長[4]。國家食源性監(jiān)測網(wǎng)對我國食源性疾病發(fā)生情況的監(jiān)測統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示,每年因V.parahaemolyticus導(dǎo)致急性腹瀉病例665.5萬人,占食源性病例的68.0%,比例遠高于發(fā)達國家水平且主要發(fā)生在我國東南沿海地區(qū)[5]。隨著經(jīng)貿(mào)及交通運輸?shù)难杆侔l(fā)展,V.parahaemolyticus引發(fā)的食物中毒已經(jīng)由沿海地區(qū)逐漸向內(nèi)地發(fā)展,已發(fā)展成為嚴(yán)重的食源性公共衛(wèi)生問題[6-7]。

流行病學(xué)研究顯示,頻繁外出就餐及貝類消費是V.parahaemolyticus感染的兩個危險因素[6]。生食或食用未完全煮熟的被該菌污染的海產(chǎn)品或鹽腌漬品會引起食物中毒,一般發(fā)病潛伏期為4～96 h[8]。主要引起急性腸胃炎,其感染率及嚴(yán)重性取決于感染劑量和菌株毒力,通常會伴隨腹瀉、腹痛、惡心、嘔吐、畏寒發(fā)熱,大便似水樣等癥狀。大部分病人發(fā)病后3 d左右恢復(fù)正常,少數(shù)嚴(yán)重病人若搶救不及時,會導(dǎo)致死亡[9]。部分臨床病例顯示,V.parahaemolyticus會引起淺表創(chuàng)傷感染,通常發(fā)生在有傷口的漁民身上[10]。若患有肝臟疾病,免疫疾病等自身免疫力低下的患者感染V.parahaemolyticus可導(dǎo)致敗血癥,嚴(yán)重威脅生命[9]。V.parahaemolyticus在環(huán)境中廣泛存在,但僅有很少一部分菌株具有致病性,且其致病能力通常是與宿主細胞之間的相互作用而決定。一般認為,致病菌的毒性及抗藥性主要是通過分泌系統(tǒng)分泌蛋白和毒素進入外界環(huán)境,或者直接作用宿主細胞的靶位點,使宿主致病,水平傳播耐藥基因[11]。本文從V.parahaemolyticus毒性相關(guān)因子及其分泌系統(tǒng)相關(guān)分泌蛋白進行概述,概括闡明近年來針對V.parahaemolyticus毒性及分泌蛋白的相關(guān)研究進展。

1 V. parahaemolyticus毒性相關(guān)因子和結(jié)構(gòu)

V.parahaemolyticus在致病過程中,菌株產(chǎn)生毒素,直接作用于宿主表面或進入宿主細胞,對細胞造成損傷及干擾破壞正常代謝或機能。這些過程與V.parahaemolyticus毒力因子息息相關(guān),主要包括溶血素、尿素酶、黏附因子和分泌系統(tǒng)等。另外,V.parahaemolyticus的鞭毛系統(tǒng),生物被膜和群體感應(yīng)也是其生存及侵入宿主的重要因子[10](圖1)。

圖1 V. parahaemolyticus毒力相關(guān)因子Fig.1 Virulence factors of V. parahaemolyticus

1.1 溶血素

溶血素(Hemolysin)是V.parahaemolyticus中首先被發(fā)現(xiàn)、鑒定的毒力相關(guān)因子,包括耐熱直接溶血素(Thermostable direct hemolysin,TDH)、耐熱直接相關(guān)溶血素(TDH-related hemolysin,TRH)和不耐熱溶血素(Thermolabile hemolysin,TLH)。其中,與V.parahaemolyticus引起的腸胃炎直接相關(guān)的是TDH和TRH。

1950年在日本大阪腸胃炎爆發(fā)期的臨床樣本中分離到的V.parahaemolyticus在我萋氏平板(Wagatsuma blood agar)上會產(chǎn)生溶血圈,這種現(xiàn)象被稱為神奈川現(xiàn)象(Kanagawa phenomenon,KP)。Sakurai等[12]首次發(fā)現(xiàn)溶血素直接作用于紅細胞,并會導(dǎo)致KP現(xiàn)象。在100 ℃條件下加熱10 min,其生物學(xué)活性不會喪失,之后將其命名為TDH。研究發(fā)現(xiàn),利用TDH制備的抗血清可以有效抑制KP現(xiàn)象,因此,TDH可用于檢測V.parahaemolyticus的致病性。除溶血活性之外,TDH作為一種成孔蛋白,可以在細胞膜上形成通道,改變細胞滲透壓,進而破壞腸上皮細胞,增加細菌的侵襲能力[13]。此外,TDH還具有心臟毒性[14-15]。

1985年在馬爾代夫爆發(fā)的腹瀉事件中,臨床分離的V.parahaemolyticus呈現(xiàn)KP陰性。研究發(fā)現(xiàn),除TDH以外,還存在另一重要致病因子—TRH[16]。此致病因子的生物學(xué)活性與TDH相似,也具有腸毒性和細胞毒性,但其對熱的耐受能力最高上限為60 ℃處理10 min[17]。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn),90%～99.8%的臨床分離株中可檢測到tdh或/和trh基因,而環(huán)境分離株中僅0.2%～10%檢測為陽性。因此,tdh和trh基因成為判定V.parahaemolyticus是否具有致病性的檢測依據(jù)[9]。

除了上述兩種溶血素之外,V.parahaemolyticus還產(chǎn)生TLH,此種溶血素只在卵磷脂存在條件下才具有溶血活性,因此并不作為其主要毒力相關(guān)溶血素[18]。但是,TLH在該菌中廣泛及特異性存在,其編碼基因tlh制備的基因探針已用于V.parahaemolyticus菌株特異性的檢測[19]。

1.2 尿素酶

尿素酶(Urease)由ure基因簇編碼,其分子質(zhì)量為275 kDa,等電點為5.2,在細菌感染中較為常見,是許多細菌重要的致病因子[20-21]。研究表明,V.parahaemolyticus尿素酶和TRH有著密切的關(guān)系。Suthienkul等[22]對分離自泰國腹瀉患者的489株V.parahaemolyticus的研究發(fā)現(xiàn),8%的菌株呈現(xiàn)尿素酶檢測陽性(Ure+),并且這些菌株均含有trh基因,而不攜帶trh的菌株,其尿素酶檢測均呈陰性(Ure-)。Okuda等[23]對1979至1995年美國西海岸分離得到的Ure+和Ure-的V.parahaemolyticus進行檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ure+菌株,分別有90%和98%攜帶tdh和trh基因,在Ure-菌株中,80%攜帶tdh而trh的檢出率則為0。因此,尿素酶可作為KP檢測為陰性的V.parahaemolyticus致病菌株的一個重要生物學(xué)標(biāo)志。

1.3 黏附因子

病原菌與宿主細胞的接觸通常是引起感染的首要條件。黏附因子分布于細胞表面或釋放到胞外,為其毒性因子與宿主細胞的接觸提供平臺[24]。研究發(fā)現(xiàn),在V.parahaemolyticus侵染過程中,莢膜多糖(Capsular polysaccharide,CPS)、甘露糖敏感血凝素(Mannose-sensitive hemagglutinin,MSHA)和多價粘附分子7(Multivalent adhesion molecule 7,MAM7)可為細菌提供對宿主細胞的黏附能力。

CPS位于細菌細胞壁外,其組成、結(jié)構(gòu)、細菌的病原性和血清型相關(guān),受LuxR-型群聚轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子OpaR的調(diào)控[25]。V.parahaemolyticus的CPS在其致病性中發(fā)揮重要作用[26]。研究表明,V.parahaemolyticus存在透明和不透明兩種菌落形態(tài),OP型菌落會產(chǎn)生更多的CPS,對上皮細胞Int-407的黏附能力比TR型高出10倍。當(dāng)TR生長轉(zhuǎn)變?yōu)镺P型時,其CPS生成能力及對細胞的黏附力也恢復(fù)到OP型菌落的水平[27-28]。

MSHA屬于IV型菌毛超家族成員,在IV型菌毛的凝血活性中起決定作用,但受甘露糖及其水解產(chǎn)物1-α-D吡喃甘露糖的特異性抑制[29-30]。研究發(fā)現(xiàn),缺失MASH的菌株,對Caco-2細胞的黏附能力下降,并且誘導(dǎo)Caco-2細胞的裂解,并且細胞圓形化和白細胞介素-8(Interleukin-8,IL-8)分泌能力隨之減弱,影響菌株對宿主細胞的黏附及致病性[31]。

MAM7在革蘭氏陰性菌中保守存在,含有高度保守的N-末端跨膜結(jié)構(gòu)域和七個哺乳動物細胞入侵(Mammalian cell entry,mce)結(jié)構(gòu)域,在細菌黏附宿主細胞的初始過程和III型分泌系統(tǒng)(T3SS)誘導(dǎo)的細胞死亡中起關(guān)鍵作用[32]。研究發(fā)現(xiàn),在非致病性大腸桿菌(Escherichiacoli)中表達MAM7,可使其產(chǎn)生細胞黏附能力[32]。抑制V.parahaemolyticus中MAM7的表達,V.parahaemolyticus對宿主細胞的黏附能力和毒性均下降。在其他存在MAM7的致病性革蘭氏陰性菌中也存在這一現(xiàn)象[33-34]。MAM7與膜磷脂酸和纖維連接蛋白相結(jié)合,在細菌與宿主細胞之間形成三分子復(fù)合物,介導(dǎo)細菌黏附宿主細胞的初始階段[32,35]。與其他已知的與脂質(zhì)配體(肌醇磷酸鹽或溶血磷脂酸)結(jié)合的蛋白,例如,Raf-1,mTOR,SHP-1不同,MAM7與宿主細胞膜磷脂酸具有高度親和特異性[36]。MAM7與纖維連接蛋白在黏附初始過程中起到拉伸作用,可增大黏附接觸面積[10]。MAM7的生物學(xué)特性,使其為V.parahaemolyticus或其他致病菌感染疾病的治療提供了潛在的藥物靶標(biāo)。

2 V. parahaemolyticus分泌系統(tǒng)概述

細菌的分泌系統(tǒng)可介導(dǎo)大分子轉(zhuǎn)運穿過細胞膜,不同細菌所分泌的蛋白質(zhì)其功能亦有差異,但研究表明,致病菌通常是通過相對較少的幾種分泌機制分泌毒性蛋白或效應(yīng)因子,當(dāng)其進入外界環(huán)境或直接作用于宿主靶位點時即可使宿主致病,目前認為有Ⅰ-Ⅸ九型[37]。其中,較常見的為Ⅰ-Ⅶ型。Ⅰ型分泌系統(tǒng)(Type I secretion system,T1SS)由ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運蛋白(ABC protein)、膜融合蛋白(Membrane fusion protein,MFP)和外膜孔道構(gòu)成,主要是一步分泌毒素、細胞表面蛋白、蛋白酶、脂肪酶、細菌素和血紅素結(jié)合蛋白[38]。Ⅱ型分泌系統(tǒng)(Type II secretion system,T2SS)由12～16個蛋白構(gòu)成,存在于細菌細胞膜、細胞質(zhì)和細胞周質(zhì)中,為兩步分泌,首先內(nèi)膜上的Sec和Tat系統(tǒng)將蛋白轉(zhuǎn)運至細胞周質(zhì),之后再由T2SS外膜蛋白將其轉(zhuǎn)運至胞外[39]。G-的IV型分泌系統(tǒng)中菌毛裝配蛋白是T2SS中相應(yīng)蛋白變體,有些時候兩種分泌系統(tǒng)共用部分蛋白[40]。Ⅲ型分泌系統(tǒng)(Type Ⅲ secretion system,T3SS)屬于一步分泌,由超過20個蛋白組裝而成,大多坐落在內(nèi)膜上,形成注射器狀結(jié)構(gòu),可以將分泌蛋白從供體胞質(zhì)直接注入到受體胞質(zhì),其中10個蛋白質(zhì)基因同G+和G-中鞭毛編碼基因同源[41]。Ⅳ型分泌系統(tǒng)(Type Ⅳ secretion system,T4SS)最初來源于F質(zhì)粒的發(fā)現(xiàn),是多基因編碼實現(xiàn)單一功能的系統(tǒng),與細菌接合機制有關(guān),介導(dǎo)基因水平轉(zhuǎn)移[42],主要用于轉(zhuǎn)移DNA、DNA-蛋白復(fù)合體和一些效應(yīng)蛋白[43]。根瘤農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)的VirB/D4 系統(tǒng)是典型的T4SS,大部分革蘭氏陰性菌中發(fā)現(xiàn)的T4SS與VirB/D4 T4SS相似,由12個蛋白質(zhì)組成,包括VirB1-VirB11和VirD4,可以形成一條包括胞外菌毛、胞質(zhì)ATP酶、核心復(fù)合物、轉(zhuǎn)運通道等結(jié)構(gòu)的橫跨整個細菌內(nèi)外膜的通道[44]。V型分泌系統(tǒng)(Type V secretion system,T5SS)是最為簡單的分泌系統(tǒng),也稱為自轉(zhuǎn)運系統(tǒng),為兩步分泌。首先經(jīng)由Sec系統(tǒng)跨內(nèi)膜轉(zhuǎn)運至細胞周質(zhì),之后再由分泌蛋白自身的C末端在外膜上形成β-筒狀通道轉(zhuǎn)移至胞外[45]。Ⅵ型分泌系統(tǒng)(Type Ⅵ secretion system,T6SS)最初在霍亂弧菌(Vibriocholerae)和銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)中被發(fā)現(xiàn),其基因簇由12～25個基因構(gòu)成,大部分微生物染色體中存在1～2個拷貝,在菌株致病性傳播上扮演重要角色[46-47]。Ⅶ型分泌系統(tǒng)(Type Ⅶ secretion system,T7SS)于2009年在結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)和牛結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumbovis)中被鑒定,共發(fā)現(xiàn)5種類型(ESX1-ESX5),與基因組島相關(guān)[48-49]。Ⅲ型分泌系統(tǒng)(Type Ⅲ secretion system,T3SS)和Ⅵ型分泌系統(tǒng)(Type Ⅵ secretion system,T6SS)在V.parahaemolyticus的毒力中起到重要作用。

2.1 Ⅲ型分泌系統(tǒng)

T3SS最早在致病性耶爾森氏菌(Yersiniaspp.)中發(fā)現(xiàn),屬于一步分泌,由超過20個蛋白組裝而成,大多坐落在內(nèi)膜上,形成注射器狀結(jié)構(gòu),可以將分泌蛋白從供體胞質(zhì)直接注入到受體胞質(zhì),其中10個蛋白質(zhì)基因同革蘭氏陽性和陰性菌中鞭毛編碼基因同源[50-51]。Tagomori[52]于2002年完成了第一株V.parahaemolyticusRIMD2210633的全基因組測序,并且發(fā)現(xiàn)該菌含有兩套III型分泌系統(tǒng)(T3SS)。測序結(jié)果顯示出V.parahaemolyticus,霍亂弧菌和其他弧菌在遺傳學(xué)上可能擁有共同的祖先[53]。V.parahaemolyticus中的T3SS分為兩套:一套位于染色體1上,稱為(T3SS1),存在于幾乎所有已測序的環(huán)境或臨床分離的V.parahaemolyticus中,基因序列與耶爾森氏菌(Yersiniavanloghem)的T3SS相似[52,54-55]。另一套位于染色體2的毒力島上,稱為T3SS2,只存在于神奈川現(xiàn)象陽性或含有編碼耐熱直接溶血素相關(guān)溶血素(TRH)基因trh的副溶血弧菌中,貢獻V.parahaemolyticus的致病力[54-55]。侵染過程中,T3SS向宿主分泌多種毒力因子(圖2),T3SS1可引發(fā)促炎性反應(yīng)、裂解細胞,具有細胞毒性,T3SS2具有腸毒性[56]。研究發(fā)現(xiàn),T3SS1缺失了編碼內(nèi)膜蛋白的vcrD1,編碼外膜蛋白的vscC1或編碼細胞周質(zhì)蛋白的vscN1任一基因后,菌株對HeLa細胞的毒性明顯降低,缺失基因互補表達后,細胞毒性恢復(fù)到原始菌株水平,但T3SS2結(jié)構(gòu)蛋白編碼基因缺失后,細胞毒性幾乎不發(fā)生改變[57-58]。

圖2 V. parahaemolyticus Ⅲ型分泌系統(tǒng)介導(dǎo)的效應(yīng)蛋白Fig.2 Type Ⅲ secreted effectors of V. parahaemolyticus

2.1.1 T3SS1結(jié)構(gòu) T3SS1系統(tǒng)可轉(zhuǎn)運的4種分泌蛋白(VopQ、VopR、VopS和VPA0450)。其中,VopQ由vp1680基因編碼,可誘導(dǎo)PI3激酶不依賴的HeLa細胞自噬,阻止小鼠巨噬細胞(RAW264.7)對副溶血弧菌的胞吞,并且作為MAPK信號途徑的激活蛋白,間接影響IL-8的分泌,是介導(dǎo)細胞毒性的主要毒力因子[59-61]。VopR位于細胞質(zhì)膜促進細胞圓形化,并不直接導(dǎo)致細胞毒性,目前的作用機理還不明確[62-63]。VopS通過抑制NF-kB的活性介導(dǎo)Toll-樣受體依賴型巨噬細胞凋亡,還能在侵染引發(fā)吞噬的早期階段,抑制宿主細胞肌動蛋白的集聚和巨噬細胞肌動蛋白的快速重排,利于病原菌抵抗巨噬細胞的吞噬,引致細胞骨架破壞,細胞變圓后裂解[64-65]。最近的研究發(fā)現(xiàn),VopQ 和VopS還會抑制炎性小體活性,有利于保護菌體免受宿主炎癥反應(yīng)誘發(fā)的機體對致炎因子的清除[66-67]。VPA0450是一種5′-磷脂酰肌醇磷酸酶,通過水解胞質(zhì)膜上的二磷酸酯,破壞細胞支架結(jié)合位點使質(zhì)膜出泡,破壞細胞膜的完整性,引起細胞裂解[68]。此外,T3SS1還介導(dǎo)其他的毒力相關(guān)蛋白的分泌,例如,VopD編碼基因缺失突變株對兔紅細胞的溶血性及細胞毒性均下降[60],Vp1659影響肌動蛋白重排同時會誘導(dǎo)細胞發(fā)生自噬[69]。

2.1.2 T3SS2功能 T3SS2系統(tǒng)轉(zhuǎn)運分泌蛋白,除VopA、VopC、VopL和VopT之外(圖1-2),還包括VopV、VopO和VopZ。VopA是一種乙酰轉(zhuǎn)移酶,可以抑制絲裂原活化蛋白激酶的信號傳遞途徑,抑制細胞分裂,引發(fā)生長停滯[70]。VopC是一種脫酰胺酶,可促進被感染細胞內(nèi)形成肌動蛋白應(yīng)力纖維,與致病性大腸桿菌的細胞毒性因子(CNF1)高度同源(38%)[71]。VopL也可促進被感染細胞內(nèi)形成肌動蛋白應(yīng)力纖維,拉長細胞的肌動蛋白[72]。VopT是一種核糖轉(zhuǎn)移酶,可將ADP-核糖體轉(zhuǎn)移到GTP酶的單體蛋白Ras上抑制其活性,對V.parahaemolyticus的侵染起了重要的作用并且貢獻了V.parahaemolyticus對Caco-2的細胞毒性[73]。VopV作為纖維狀肌動蛋白結(jié)合效應(yīng)器,在含有T3SS2的V.parahaemolyticus中貢獻腸毒性[74]。VopO作為T3SS2關(guān)鍵的效應(yīng)蛋白,可激活RhoA-ROCK途徑,促進T3SS2依賴型應(yīng)力纖維的形成,同時參與到對上皮細胞的破壞[75]。VopZ通過抑制一種炎癥反應(yīng)相關(guān)酶TAK1引發(fā)腹瀉及腸道疾病[76]。另外,V.parahaemolyticus中新發(fā)現(xiàn)的一種T3SS2效應(yīng)蛋白VPA1380是一種需要肌醇己糖磷酸(IP6)誘導(dǎo)的半胱氨酸蛋白酶,在酵母中表達,對菌株產(chǎn)生毒性[77]。

2.2 Ⅵ型分泌系統(tǒng)

T6SS最初在霍亂弧菌(Vibriocholerae)和銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)中被發(fā)現(xiàn),其基因簇由12～25個基因構(gòu)成,大部分細菌染色體中存在1～2個拷貝,為倒置的T4噬菌體結(jié)構(gòu),在細菌致病性傳播上扮演重要角色,介導(dǎo)細菌對宿主細胞的黏附作用[78-79]。T6SS在37 ℃條件下無活性,其對宿主的影響主要不是通過分泌蛋白來完成,可能還依靠于其他的毒力因子[80]。與T3SS相似,根據(jù)所處位置不同,T6SS分為T6SS1和T6SS2。T6SS1只存在臨床分離的V.parahaemolyticus中,而T6SS2在環(huán)境與臨床分離株中均存在[80-81]。T6SS1在溫暖的海洋環(huán)境中(3% NaCl,30 ℃)較為活躍,可通過三種效應(yīng)蛋白(VP1415,VP1388和VPA1263)抵抗環(huán)境中其他細菌分泌的有害物質(zhì)并選擇性的抑制其他細菌的生長,增強其的環(huán)境適應(yīng)性[82-83]。T6SS2在低鹽低溫環(huán)境中(1% NaCl,23 ℃)較為活躍。研究發(fā)現(xiàn),T6SS1的結(jié)構(gòu)基因(icmF1)和效應(yīng)蛋白(hcp1)的缺失,會降低該菌對HeLa和Caco-2細胞的黏附能力,而T6SS2相關(guān)基因缺失僅影響細菌對HeLa細胞的黏附能力[84]。

2.2.1 T6SS結(jié)構(gòu) 不同細菌中T6SS結(jié)構(gòu)蛋白相對比較保守,構(gòu)成了分泌系統(tǒng)的核心組件。這些蛋白包括IcmF-和IcmH-樣蛋白、脂蛋白、ClpV以及轉(zhuǎn)位蛋白Hcp和VgrG[11]。位于細菌細胞膜中的T6SS的核心組件DotU和IcmF,對分泌系統(tǒng)的穩(wěn)定至關(guān)重要[85]。目前,研究T6SS中最為關(guān)注的一個結(jié)構(gòu)蛋白是IcmF,它參與Hcp導(dǎo)管的形成與跨膜,缺失了IcmF編碼基因的細菌無法在上清中檢測到Hcp蛋白[46,86-87]。

轉(zhuǎn)位蛋白包括Hcp和VgrG,Hcp和VgrG分別類似噬菌體尾巴和尾穗蛋白,它們共同構(gòu)成T6SS裝置整個細胞外部分,形成分泌蛋白的管道,幫助分泌蛋白跨膜轉(zhuǎn)運,最終到達宿主表面[88]。Hcp是一個內(nèi)徑為40 nm的六環(huán)形,當(dāng)T6SS處于活化狀態(tài)時,Hcp在細胞周質(zhì)中疊成長導(dǎo)管,嵌合于VgrG下面,能夠穿過細菌外膜;VgrG類似T4噬菌體穿刺細胞膜的針尖狀結(jié)構(gòu),能夠穿刺細菌細胞膜并將DNA注入到細菌的細胞質(zhì)中[89]。一旦與宿主細胞接觸,VgrG針尖狀結(jié)構(gòu)會穿透脂蛋白雙分子層,將原本隱藏的效應(yīng)區(qū)域暴露于宿主細胞質(zhì)中,使之與宿主細胞靶分子相互作用,繼而影響宿主細胞功能。當(dāng)VgrG針尖狀結(jié)構(gòu)從T6SS脫離后,會形成沒有加蓋的Hcp管道,效應(yīng)蛋白會通過此管道進入宿主細胞,這也闡明了T6SS和噬菌體尾部刺突在結(jié)構(gòu)和進化上的關(guān)系[89]。

2.2.2 T6SS功能 目前研究T6SS的熱點問題集中在其對巨噬細胞的細胞毒性上。研究發(fā)現(xiàn)霍亂弧菌V52感染巨噬細胞J774后,細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化,構(gòu)建icmF樣基因vasK突變株感染巨噬細胞后發(fā)現(xiàn),細胞形態(tài)無明顯變化,由此推測出T6SS介導(dǎo)霍亂弧菌對巨噬細胞的毒性[46]。對嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)的T6SS研究發(fā)現(xiàn),其對HeLa細胞也具有細胞毒性?；魜y弧菌T6SS的主要結(jié)構(gòu)蛋白IcmF在體外被證實能夠促進細菌對腸上皮細胞的枯附能力[89]。缺失icmF的雞致病性大腸桿菌能夠降低對上皮細胞的粘附能力。由此推測T6SS介導(dǎo)細菌對細胞的粘附能力?；魜y弧菌的轉(zhuǎn)位蛋白VgrG1的C端含有肌動蛋白交聯(lián)相關(guān)結(jié)構(gòu)域(ACD domain),在體外試驗中,VgrG1能與可以共價性的結(jié)合肌動蛋白,擾亂宿主細胞的肌動蛋白骨架[88]。

Parsons等[90]研究發(fā)現(xiàn)T6SS在鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)中能夠限制細菌在巨噬細胞中的復(fù)制能力,降低毒力,從而使細菌在巨噬細胞中長期存活。Chow等[91]發(fā)現(xiàn)缺失了T6SS的關(guān)鍵蛋白后,幽門螺旋菌(Helicobacterpylori)對小昆腸道上皮細胞(IEC)的粘附和定殖能力升高,感染的免疫缺陷小鼠的炎癥反應(yīng)加劇,T6SS降低了肝幽門螺旋菌在宿主內(nèi)的生長能力和毒力。Weber等[92]發(fā)現(xiàn)缺失了T6SS結(jié)構(gòu)基因和轉(zhuǎn)位基因的鰻弧菌(Vibrioanguillarum)在高氧化性,高酒精度以及低pH的條件下,其存活率要明顯低于親本細菌。由此可以得出T6SS具有致病力的同時也可以限制細菌的復(fù)制和致病力,并且有利于鰻弧菌適應(yīng)外界環(huán)境。

3 鞭毛、生物被膜與群體感應(yīng)

V.parahaemolyticus具有兩種類型的鞭毛,一種為單端生鞭毛,由6種鞭毛蛋白組成,決定其游動能力,在pH8的高鹽環(huán)境中,具有單端生鞭毛的菌株運動速度可達60 μm/s[58]。另一種為周生鞭毛,當(dāng)V.parahaemolyticus生存于過于黏稠或離子缺乏的環(huán)境條件下,菌株游動性被抑制,此時會產(chǎn)生許多無鞘的周生鞭毛,引起菌株集聚,而細菌的群體感應(yīng)通過自身誘導(dǎo)物質(zhì)(Auto-inducer,AI)的信號分子,感知環(huán)境中細菌菌群的數(shù)量,繼而啟動菌體中相關(guān)基因的表達,產(chǎn)生毒素、形成生物膜來適應(yīng)環(huán)境的變化[93]。鞭毛系統(tǒng)、生物被膜、群體感應(yīng)與細胞黏附相互關(guān)聯(lián),同黏附因子相似,可為細菌與宿主細胞的接觸提供平臺,在細菌侵染的初始階段起關(guān)鍵作用并同時參與到菌株對抗生素的耐受性,引發(fā)較為嚴(yán)重的臨床問題[94]。

4 總結(jié)

V.parahaemolyticus是一種重要的食源性致病菌,廣泛存在與海洋環(huán)境中。近年來,隨著對V.parahaemolyticus分泌蛋白研究的不斷深入,已能從致病性和耐藥性傳播方面更好的闡述其作用機制。但未來仍有很多問題需要解決,例如:宿主細胞內(nèi)不同的分泌蛋白是如何發(fā)揮功能的,分泌途徑是如何識別底物的,各分泌系間是否存在相互作用。另外,相對于其他分泌系統(tǒng),T6SS的探索還處在初級階段,對于上述問題的探索和理解在細菌致病機理及制定相應(yīng)防控措施上具有重要意義。