不同提取方法的毛建草精油抗氧化動力學(xué)研究

(忻州師范學(xué)院化學(xué)系,山西忻州 034000)

毛建草(DracocephalumrupestreHance)是一種唇形科青蘭屬草本植物[1]。其株高約15～42 cm,全草具有香味,可做茶飲,因而又俗稱“毛尖”[2]。除了作為地方茶在本地供飲用外,它本身還具有很高的藥用價值。研究發(fā)現(xiàn),毛建草屬植物具有抗氧化、防治心血管疾病、抗衰老、防腫瘤、供氧[3-7]等多種功能,因而對毛建草的研究有利于對其開發(fā)利用。

目前,有很多關(guān)于毛建草的研究成果。李慧卿等[8]發(fā)現(xiàn)毛建草含有豐富的、具有較強抗氧化性作用的茶多酚;任冬梅等[9]、歐陽丹薇[10]用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)、高效液相色譜法對毛建草有效成分進行了分離和鑒定,發(fā)現(xiàn)了多種黃酮類物質(zhì);鄭曉敏等[11]測定出了毛建草葉中含有的多種人體微量元素。Zhu等[12]報道毛建草提取物對實驗小鼠肝損傷有保護作用,Jing等[13]研究發(fā)現(xiàn)毛建草提取物對Aβ25-35肽氧化有一定的抑制作用,也有一些研究者探究了毛建草糖苷提取物藥用機理[14-15]。但是關(guān)于賦予毛建草芳香氣味的物質(zhì)研究報道較少。而植物的香味組分,多是由于其具有揮發(fā)性的“精油”[16]。它除了能帶給人感官愉悅之外,還具有增香、殺菌、抗病毒和抗氧化等生物活性,在香料、化妝品、食品工業(yè)、制藥、醫(yī)療及農(nóng)業(yè)蟲害防治等方面都有廣泛應(yīng)用[17-19],享有“液體黃金”之佳譽。而毛建草精油的相關(guān)研究較少。

本文采用傳統(tǒng)的溶劑浸提和水蒸氣蒸餾方法分別得到精油產(chǎn)品[20-21],進而研究來源于不同方法的產(chǎn)品對DPPH·的清除作用以及其抗氧化動力學(xué),以求為進一步利用不同的毛建草精油產(chǎn)品,以及其抗氧化性開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

毛建草 購于忻州市寧武縣管涔山農(nóng)戶,為其頭年采摘自然晾干干品,包括桿、葉等全草;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH·) 英國Alfa Aesar公司;蘆丁 分析純,國藥集團。

UV-2550紫外可見分光光度計 日本島津公司;CF-B電熱恒溫水浴鍋 河北晟興儀器;80-2B電動離心機 常州國華電器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 毛建草精油的提取

1.2.1.1 水蒸氣蒸餾法 稱取10 g毛建草粉末于圓底燒瓶中,按料液比1∶6 (g/mL)加入4%的NaCl溶液,浸泡2 h后水蒸氣蒸餾,保持微沸2 h,收集餾分,得到精油溶液。用適量石油醚萃取所得精油溶液,萃取三次后棄去水相,收集萃取液,在30 ℃下旋蒸除去石油醚,得到精油產(chǎn)品[22],重復(fù)3次,合并產(chǎn)品,得其提取率為1.70‰。

1.2.1.2 溶劑浸提法 稱取10 g毛建草粉末于圓底燒瓶中,按照液料比6∶1加入石油醚,密封浸泡2 h后進行回流操作,保持微沸反應(yīng)2 h,冷卻后抽濾,收集濾液,離心后收集上清液,得到精油溶液。在30 ℃下旋蒸除去石油醚,得到精油產(chǎn)品,重復(fù)3次,合并產(chǎn)品,得其提取率為4.54‰。

1.2.2 DPPH·清除率測定 稱取0.0079 g的DPPH·于燒杯中,用無水乙醇溶解,將溶液轉(zhuǎn)移到100 mL容量瓶中,定容,配制成2×10-4mol·L-1的溶液,低溫避光保存。

將水蒸氣蒸餾、溶劑浸提法得到的毛建草精油,用無水乙醇稀釋成體積比為1∶10的兩組樣品液。每組再分別取樣品液0、100、200、300、400、500 μL于6支比色皿中,然后加入無水乙醇及1 mL 2×10-4mol·L-1的DPPH·溶液,使總體積為2 mL,從而分別得到體積分數(shù)為0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5% 的精油溶液,混勻,避光放置30 min,在517 nm處吸光度[23]。DPPH·清除率計算公式為:

式中,A:加入毛建草精油時DPPH·溶液的吸光度;A0:毛建草精油在測定波長處的吸光度;A1:未加入毛建草精油時DPPH·溶液的吸光度。

1.2.3 抗氧化動力學(xué)研究

1.2.3.1 精油初始濃度對清除DPPH·動力學(xué)的影響 在精油初始濃度對清除DPPH·動力學(xué)的影響實驗中,按實驗1.2.2方法,取精油體積分數(shù)分別為0.5%、1%、1.5%等3個樣品與DPPH·迅速混勻,檢測其517 nm處吸光度隨時間變化。

1.2.3.2 溫度對清除DPPH·動力學(xué)的影響 在溫度對精油清除DPPH·動力學(xué)的影響實驗中,精油樣品取體積分數(shù)為1.5%,分別于30、37、45 ℃下檢測。溫度通過樣品池與水浴鍋連通,預(yù)先設(shè)置到所需要溫度。

1.2.4 毛建草蒸餾精油與蘆丁共存時對DPPH·的清除作用 量取一定體積的蒸餾精油稀釋樣品液于燒杯,稱重;然后量取相同體積的乙醇,加入固體蘆丁,使總質(zhì)量與精油溶液相等,得蘆丁溶液濃度為0.04 mg·mL-1。配制蘆丁、毛建草蒸餾精油1∶1混合溶液。

蘆丁樣品液分別取1、2、3、4、5 mL,操作同1.2.2。蒸餾精油以及兩者混合液同蘆丁操作,測定其對DPPH·的清除率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗記錄數(shù)據(jù)用Excel 2013處理,由Origin 8.6 作圖形文件。擬合直線及擬合參數(shù)都用Origin 8.6軟件生成。

2 結(jié)果與分析

2.1 毛建草精油對DPPH·的清除率

采用水蒸氣蒸餾、溶劑浸提法兩種方法得到的毛建草精油產(chǎn)品對DPPH·的清除率結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同方法提取的毛建草精油對DPPH·的清除率Fig.1 DPPH· scavening rate of essential oils extractedfrom Dracocephalum rupestre Hance by different methods

兩種方法得到的毛建草精油都對DPPH·有明顯的清除效果,并且是隨著濃度的增加清除率增加。同等濃度下,浸提精油產(chǎn)品對DPPH的清除率遠遠大于蒸餾精油,但隨著濃度的增加,清除率增加較緩慢;而水蒸氣蒸餾精油產(chǎn)品,雖然起始清除率相對較小,但隨著濃度增加,清除率逐漸增大,兩者之間的清除率差異逐漸減小。在精油體積分數(shù)為2.5% 時,浸提精油清除率達到81.56%,而蒸餾精油為57.78%。即浸提精油產(chǎn)品的自由基清除能力相對更強,在低濃度時就有很高的活性,而餾出精油需要較大的濃度才能實現(xiàn)對自由基的清除作用。

毛建草對自由基有較強的清除作用,是由于其含有多酚、黃酮類、多糖等多種抗氧化成分[3]。除了多糖類不易溶于有機溶劑,在浸提產(chǎn)品中易被過濾除去之外,仍有多酚、黃酮類等其他組分殘留在溶劑中,因而毛建草浸提液有較強的清除自由基能力。而蒸餾餾分主要為毛建草揮發(fā)性香味組分,組成相對單一。盡管該組分清除自由基能力弱于浸提液,實驗顯示仍有較強的自由基清除能力。

2.2 毛建精油的抗氧化動力學(xué)研究

2.2.1 毛建溶劑浸提精油清除DPPH·動力學(xué)

2.2.1.1 溶劑浸提精油初始濃度對清除DPPH·動力學(xué)的影響 分別取不同初始濃度的精油提取液,檢測其對DPPH·的清除作用,結(jié)果見圖2。不同初始濃度下,精油清除自由基的動力學(xué)基本相似。首先,清除能力隨時間近乎線性增強,而后清除能力逐漸減緩,最后達到平衡,與許多抗氧化劑對自由基的清除動力學(xué)曲線相似[24-25]。比較不同濃度下,精油對自由基的清除動力學(xué)可以發(fā)現(xiàn),隨著濃度的增大,清除反應(yīng)速率明顯加快:當(dāng)加入精油體積分數(shù)為0.5%時,反應(yīng)25 min才達到平衡;當(dāng)精油初始濃度體積分數(shù)達1.5%時,約20 min反應(yīng)就達到了平衡。隨著提取液初始濃度增大,到達平衡時DPPH·自由基清除率增大。

圖2 不同初始濃度浸提精油清除DPPH·動力學(xué)Fig.2 DPPH· scavening kinetics of essential oilby solvent extraction with different initial concentrations

2.2.1.2 溫度對溶劑浸提精油清除DPPH·動力學(xué)的影響 為了識別毛建草浸提精油對DPPH·自由基清除能力是否受溫度的影響,精油在不同溫度下清除自由基的動力學(xué)相比較。圖3是浸提精油初始濃度均為1.5% 時,分別在30、37、45 ℃下清除DPPH·的動力學(xué)曲線。在實驗溫度范圍內(nèi),DPPH·清除曲線特征基本沒有發(fā)生改變,只是隨著溫度升高,到達平衡時時間縮短,平衡時浸提精油產(chǎn)品的自由基清除率提高,與文獻[26]結(jié)果一致。升高溫度,反應(yīng)速率加快,清除反應(yīng)較快達到平衡,清除率也有所提高。

圖3 不同溫度下浸提精油清除DPPH·動力學(xué)Fig.3 DPPH· scavening kinetics of essential oilby solvent extraction with different temperatures

2.2.2 毛建草蒸餾精油清除DPPH·動力學(xué)

2.2.2.1 蒸餾精油初始濃度對清除DPPH·動力學(xué)的影響 室溫下,分別取不同量的餾出精油,檢測其對DPPH·的清除作用,結(jié)果見圖4。相同時間下,不同初始濃度餾出精油對自由基的清除能力,隨著濃度的增大而增強。

圖4 不同初始濃度餾出精油清除DPPH·動力學(xué)Fig.4 DPPH· scavening kinetics of distillate essential oilwith different initial concentrations

2.2.2.2 溫度對毛建草餾出精油清除DPPH·動力學(xué)的影響 在溫度30、37、45 ℃范圍內(nèi),毛建草餾出精油清除DPPH·動力學(xué)曲線基本相似,如圖5所示。隨著時間的延長,清除DPPH·先快后慢,后逐漸趨緩,最后實現(xiàn)平衡。

圖5 不同溫度下餾出精油清除DPPH·動力學(xué)Fig.5 DPPH· scavening kinetics ofdistillate essential oil with different temperatures

2.3 毛建精油抗氧化動力學(xué)參數(shù)的分析

根據(jù)已有的數(shù)學(xué)模型,將實驗測得的數(shù)據(jù)進行相應(yīng)的擬合,可近似推斷DPPH·自由基清除的動力學(xué)過程。零級反應(yīng)描述的是反應(yīng)速率不依賴于反應(yīng)物濃度改變而變化,以自由基殘存百分率對時間做圖(100-K)-t,應(yīng)為線性;一級、二級反應(yīng)動力學(xué)分別表現(xiàn)為ln(100-K)-t、1/(100-K)-t為線性。

2.3.1 毛建草溶劑浸提精油清除DPPH·動力學(xué)參數(shù) 根據(jù)不同動力學(xué)模型,把30 ℃下清除率隨時間的變化曲線進行擬合,擬合結(jié)果見表1。比較不同模型的決定系數(shù)可以看出,溶劑浸提精油清除DPPH·的動力學(xué)過程更符合二級反應(yīng)模型(R2=0.9543)。

表1 溶劑浸提精油清除DPPH動力學(xué)擬合方程Table 1 Fitting equation of DPPH· scavening kinetics ofessential oil by solvent extraction

把不同溫度下的動力學(xué)曲線,根據(jù)二級反應(yīng)進行擬合,結(jié)果如圖6,由相應(yīng)的截距及斜率可以求出對應(yīng)溫度下該反應(yīng)的速率常數(shù)k(表2)。以lnk對溫度的倒數(shù)1/T作圖,根據(jù)Arrhenius(lnk=lnA-Ea/RT),直線的截距為lnA,斜率為-Ea/R,由此計算反應(yīng)的活化能Ea(kJ·mol-1)、阿累尼烏斯常數(shù)A(表2)。

圖6 不同溫度下浸提精油清除DPPH·二級反應(yīng)動力學(xué)擬合曲線Fig.6 Fitting lines of DPPH· scavening kinetics ofessential oil by solvent extraction accordingto second-order reaction at different temperatures

由表2可知,毛建草浸提精油與DPPH·的反應(yīng)中,反應(yīng)的速率常數(shù)k隨溫度T的升高而增加,但變化幅度都比較小,由于反應(yīng)活化能Ea,以及常數(shù)A比較小,因此反應(yīng)溫度對該反應(yīng)速率影響不大。

表2 不同溫度下浸提精油清除DPPH·二級反應(yīng)動力學(xué)擬合參數(shù)Table 2 Fitting parameters of DPPH· scavening kinetics ofessential oil by solvent extraction accordingto second-order reaction at different temperatures

2.3.2 毛建草蒸餾精油清除DPPH·動力學(xué)參數(shù) 毛建草餾出精油對DPPH·清除率動力學(xué)根據(jù)不同反應(yīng)級數(shù)擬合結(jié)果見表3。比較其決定系數(shù),可以看出反應(yīng)更趨向于二級反應(yīng)模型(R2=0.9522)。

表3 餾出精油清除DPPH·動力學(xué)擬合方程Table 3 Fitting equation of DPPH·scavening kinetics of distillate essential oil

把不同溫度下的動力學(xué)曲線,根據(jù)二級反應(yīng)進行擬合,結(jié)果如圖7,由相應(yīng)的截距及斜率可以求出對應(yīng)溫度下該反應(yīng)的速率常數(shù)k(表4)。以lnk對溫度的倒數(shù)1/T作圖,計算反應(yīng)的活化能Ea、阿累尼烏斯常數(shù)A(見表4)。

圖7 不同溫度下餾出精油清除DPPH·二級反應(yīng)動力學(xué)擬合曲線Fig.7 Fitting lines of DPPH· scavening kinetics ofdistillate essential oil according to second-orderreaction with different temperatures

表4 不同溫度下毛建草餾出精油清除DPPH·二級反應(yīng)動力學(xué)擬合參數(shù)Table 4 Fitting parameters of DPPH· scavening kinetics ofdistillate essential oil according to second-orderreaction with different temperatures

由表4可知,毛建草精油與DPPH·的反應(yīng)中,反應(yīng)的速率常數(shù)k隨溫度T的升高而增加。與毛建草浸提精油相比,餾出精油對自由基的清除反應(yīng)活化能Ea、以及常數(shù)阿累尼烏斯常數(shù)A稍大,反應(yīng)溫度對該反應(yīng)速率常數(shù)k影響要比溶劑浸提精油大。

2.4 毛建草餾出精油與蘆丁共存時對DPPH·的清除作用

加入同體積精油,溶劑浸提法得到的產(chǎn)品清除DPPH·的能力明顯高于水蒸氣蒸餾產(chǎn)品。除了兩種精油產(chǎn)品組分、含量有相對差異外,組分間的協(xié)同作用也是一個可能的因素。由于毛建草含有較多的黃酮類成分[8],溶劑浸提精油比蒸餾精油不可避免地會額外多引入該類物質(zhì)(黃酮類物質(zhì)中沸點較高的物質(zhì)不容易經(jīng)蒸餾餾出,而由于其芳環(huán)的脂溶性,會溶于有機浸提溶劑中),多出的黃酮組分對清除自由基會有貢獻,當(dāng)精油與這些黃酮存在協(xié)同作用時,會進一步提高對自由基的清除率。為了探討毛建草餾出精油與草中黃酮類組分是否存在協(xié)同作用,為其適配做理論基礎(chǔ),以蘆丁為黃酮替代品,繼續(xù)研究了毛建草蒸餾精油與其共存時對DPPH·的清除作用。

圖8是反應(yīng)45 min時,不同濃度的蘆丁、毛建草餾出精油、毛建草餾出精油與蘆丁1∶1的混合溶液對DPPH·的清除率。相同濃度的蘆丁與餾出精油相比,蘆丁對DPPH·的清除率明顯優(yōu)于毛建草餾出精油。蘆丁在低濃度時其對DPPH·的清除率隨濃度幾乎呈線性變化,但隨著濃度加大清除率逐漸趨于平緩;毛建草餾出精油對DPPH·的清除率在實驗范圍內(nèi)呈現(xiàn)近乎線性的增長趨勢,但清除能力遠低于蘆丁;而混合溶液對DPPH·的清除率同濃度下只略高于毛建草餾出精油。如果毛建草餾出精油與蘆丁各自獨立執(zhí)行清除自由基功能,在各自線性范圍內(nèi),其混合溶液對DPPH·的清除率應(yīng)為其擬合虛線(各組分1/2濃度時清除率的和)。而實際混合溶液的DPPH·清除曲線,與之相比明顯偏低。這意味著毛建草餾出精油在與蘆丁共存下,清除DPPH·能力受到抑制,二者之間不僅沒有協(xié)同作用,還存在拮抗作用。

圖8 餾出精油、蘆丁及兩者1∶1混合液對DPPH·的清除率Fig.8 DPPH· scavening rates of distillateessential oil,rutin and their mixture(1∶1)

分別對其DPPH·清除曲線線性部分進行擬合,求其IC50,結(jié)果如表5,IC50(蘆丁)

表5 餾出精油、蘆丁的DPPH·清除反應(yīng)的IC50值Table 5 IC50values of distillate essential oil,rutinand their mixture(1∶1)for DPPH· scavening reaction

有文獻報道,協(xié)同抗氧化主要是由于抗氧化組分間相互發(fā)生作用形成復(fù)合物,因而對自由基(或其他氧化組分)清除作用增強[27-28]。經(jīng)氣相色譜檢測,毛建草的主要揮發(fā)性組分為酯類、芳香醛類、酮及酚類、芳香醇類,它們可提供一些活性基團與蘆丁發(fā)生作用(或形成pi-pi作用),從而可能影響到了自身對DPPH·的清除效力,使總體效力下降。產(chǎn)生抗氧化協(xié)同作用的原因,在毛建草精油與蘆丁間可能也正是使其產(chǎn)生拮抗的原因。只是溶劑浸提液中組分較為復(fù)雜,實驗中僅僅以蘆丁作為黃酮替代,并不能完全反映溶液中的真實狀況,可能多種組分間同時存在著協(xié)同和拮抗,最終體現(xiàn)出來的只是綜合效應(yīng)。這些有待進一步探索。

3 結(jié)論

溶劑浸提毛建草精油與蒸餾得到的毛建草精油都具有抗氧化性,在精油體積分數(shù)為2.5% 時,浸提精油的清除率達到81.56%,而蒸餾精油為57.78%,相同體積濃度下溶劑浸提產(chǎn)品抗氧化性更強;在實驗條件下,兩者清除DPPH·自由基的動力學(xué)曲線更接近二級反應(yīng),提高濃度與溫度都可加速其反應(yīng);毛建草蒸餾精油與蘆丁清除DPPH·的IC50值依次為0.034、0.006 mg/mL,而其1∶1混合物為0.012 mg/mL,明顯高于二者的擬合值0.009 mg/mL,說明蒸餾得到的毛建草精油與黃酮類物質(zhì)蘆丁,不存在協(xié)同作用,反而存在拮抗作用。本研究為更好地利用和開發(fā)不同的精油產(chǎn)品提供了借鑒與思路。