昆侖雪菊油樹脂成分分析及體內(nèi)外抗氧化性活性研究

楊金梅,王德萍

(新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,新疆烏魯木齊 830046)

昆侖雪菊(Kunlun chrysanthemum)原產(chǎn)于美國的中西部地區(qū),又名金雞菊,主要分布在海拔高度3000 m左右的新疆和田地區(qū),是新疆區(qū)域比較有特色的菊花品種之一,昆侖雪菊主要含有黃酮、多糖、皂苷、氨基酸、揮發(fā)油等成分,具有降血脂、降血壓、抗癌、抗衰老等作用[1-3]。昆侖雪菊油樹脂(Kunlun chrysanthemum oleoresin)是采用超臨界的方法將昆侖雪菊花中的香氣和風(fēng)味成分萃取出來,再利用溶劑蒸餾回收,制成黏稠狀的昆侖雪菊油樹脂。因?yàn)槔鲅┚沼蜆渲艽硐阈亮现械南銡?、有效成分以及風(fēng)味,幾乎能把香辛料中全部的風(fēng)味和香氣成分表現(xiàn)出來,因此昆侖雪菊油樹脂在特性和應(yīng)用方面具備了比昆侖雪菊花更突出的優(yōu)點(diǎn)[4-7]。

自由基是生物體內(nèi)新陳代謝過程中產(chǎn)生的一類具有高度活性、含有未配對電子的物質(zhì),過量的自由基會導(dǎo)致生物膜、酶、維生素、蛋白質(zhì)及活細(xì)胞功能過氧化損傷。氧化應(yīng)激(Oxidative stress,OS)是指體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡,傾向于氧化,導(dǎo)致中性粒細(xì)胞炎性浸潤,蛋白酶分泌增加,產(chǎn)生大量氧化中間產(chǎn)物,在體內(nèi)是一種負(fù)面作用[8]。而消除氧化應(yīng)激最有效的方法是使用抗氧化劑[9]。研究表明,油樹脂的成分主要有精油、辛辣成分、色素、樹脂及一些非揮發(fā)性的油脂和多糖類化合物。與精油相比,油樹脂的香氣更豐富,口感更豐滿,具有抗菌、抗氧化等功能。油樹脂能大大提高香料植物中有效成分的利用率。例如,桂皮直接用于烹調(diào),僅能利用有效成分的25%,制成油樹脂則可達(dá)95%以上?？梢?油樹脂已成為辛香料的重要發(fā)展方向[10-11]。且研究表明,有些草本植物、香辛料以及其提取物具有抗氧化活性[12]。因此,有必要對昆侖雪菊油樹脂進(jìn)行成分分析及體內(nèi)外抗氧化性活性研究。

本實(shí)驗(yàn)采用超臨界的方法制備昆侖雪菊油樹脂,采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)技術(shù)對雪菊油樹脂脂肪酸進(jìn)行成分分析,通過昆侖雪菊油樹脂對二苯代苦味?；杂苫?DPPH·)、羥基自由基(·OH)的清除率的測定,總還原能力的體外實(shí)驗(yàn)以及測定小鼠血清、肝臟和腎臟中超氧化物歧化酶(SOD)活力、丙二醛(MDA)含量和總抗氧化(T-AOC)能力的體內(nèi)實(shí)驗(yàn),從而研究雪菊油樹脂脂的體內(nèi)外抗氧化特性,以期為昆侖雪菊的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

昆侖雪菊 由新疆和田沙漠玫瑰有限責(zé)任公司提供;T-AOC試劑盒、SOD試劑盒、MDA 試劑盒 南京建成生物工程研究所;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH·) (純度>97%),上海源葉生物科技有限公司;昆明小鼠6～8周齡,體重20±2 g 新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物飼養(yǎng)中心購買,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號:SCXK(新)2011-0003,新疆維吾爾自治區(qū)科學(xué)技術(shù)廳頒發(fā);硫酸亞鐵、過氧化氫、無水乙醇等試劑 均為市售國產(chǎn)分析純。

HH-S24型電熱恒溫水浴鍋 鞏義市英峪予華儀器廠;FW-100高速萬能粉碎機(jī) 北京市永光明醫(yī)療儀器廠;RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;512GD紫外-可見光分光光度計(jì) 上海分析儀器總廠;DHG-9123A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科技有限公司;SFE221-50-06超臨界萃取裝置 南通華興石油儀器有限公司;SHB-Ⅲ循環(huán)式多用真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司;Spe-edTM SFE-2玻璃儀器氣流烘干器 Universal Analytical & Test Instrument Ltd.;QP2010氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 上海一恒科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 昆侖雪菊油樹脂的制備 制備流程[13]:昆侖雪菊花干燥粉末→超臨界CO2萃取→離心(3500 r/min,15 min)→收集上清液→旋蒸乙醇→昆侖雪菊油樹脂。

操作要點(diǎn):將昆侖雪菊花經(jīng)過電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱60 ℃干燥,再通過高速萬能粉碎機(jī)粉碎成粉末,過60目篩,再通過超臨界CO2萃取。超臨界CO2萃取條件:萃取時(shí)間100 min、萃取溫度45 ℃、萃取壓力20 MPa、夾帶劑用量150 mL、CO2流量為20 L/h,從分離釜取出昆侖雪菊油樹脂,在60 ℃的條件下旋蒸去除無水乙醇,得到昆侖雪菊油樹脂。

1.2.2 昆侖雪菊油樹脂脂肪酸成分分析 所得昆侖雪菊油樹脂用無水硫酸鈉脫水,過濾后量取體積。取適量油樹脂用正己烷溶解稀釋為體積分?jǐn)?shù)0.1%,用于氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析。樣品測定前置于-25 ℃下密封貯存。

1.2.2.1 甲酯化處理 吸取-25 ℃下密封貯存的昆侖雪菊油樹脂3 mL于試管中,加入5 mL石油醚和乙醚(V/V=4∶3)混合溶液,加入0.5 mol/L氫氧化鉀-甲醇溶液4 mL,振蕩,靜置10～15 min,加入蒸餾水,靜置分層,取上清液進(jìn)樣分析。采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)進(jìn)行成分分析。

1.2.2.2 GC-MS條件 通過對色譜柱類型、分流比、程序升溫條件的考察,結(jié)合實(shí)驗(yàn)室前期的實(shí)驗(yàn)條件,最終確定GC-MS條件。

GC條件:色譜柱為RTX-50石英毛細(xì)管柱(30 mm×0.25 mm×0.25 μm);程序升溫:初始溫度120 ℃,保持10 min,以3 ℃/min,升溫至230 ℃,保持10 min。進(jìn)樣口溫度250 ℃,出樣口溫度200 ℃,檢測電壓350 V,載氣氦氣(純度>99.999%),進(jìn)樣量1 μL,分流比20∶1,載氣流速0.8 mL/min。

MS條件:EI離子源,電源溫度200 ℃,電子能量70 eV,發(fā)射電流200 μA,質(zhì)量掃描范圍(m/z):20～550,檢測器電壓為1756 V。

1.2.3 體外抗氧化活性的測定

1.2.3.1 羥自由基清除率的測定 參考李姣等[14]的方法,在10 mL比色管中依次加入2 mL 6 mmol/L的硫酸亞鐵和水楊酸-乙醇溶液,再加入用無水乙醇配制的濃度分別為0.05、0.08、0.2、0.4、0.5、0.8、1 mg/mL的昆侖雪菊油樹脂樣品(陽性對照:特丁基對苯二酚(TBHQ))各2 mL,用微型混合器混勻,最后加入2 mL 1%的過氧化氫,水浴30 min,在510 nm波長處測定吸光度(ΔA),然后根據(jù)下面公式計(jì)算清除率:

清除率(%)=[(ΔA0-ΔA)/ΔA0]×100

式中:ΔA0:不加樣品的吸光度;ΔA:加入樣品的吸光度。

1.2.3.2 DPPH自由基清除率的測定 參考Locatelli等[15]的方法,在10 mL比色管中依次加入用無水乙醇配制的濃度分別為0.2、0.4、0.5、1、1.6、2 mg/mL的昆侖雪菊油樹脂樣品(陽性對照:特丁基對苯二酚(TBHQ))各2 mL,再加入2.0 mL 2×10-4mol/L的DPPH·甲醇溶液,將混合溶液劇烈振蕩1 min,在室溫下避光放置30 min后,在517 nm波長處測定吸光度(Ai),然后根據(jù)下面公式計(jì)算清除率:

清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/Ac]×100

式中:Ai:樣品液與DPPH·混合液的吸光度;Aj:樣品液與無水乙醇混合液的吸光度;Ac:DPPH溶液與無水乙醇混合液的吸光度。

1.2.3.3 總還原力的測定 參考陳晉芳[16]、Baschieri等[17]的方法,在1 mL用無水乙醇配制的濃度分別為0.02、0.04、0.05、0.08、0.2、0.4、0.5 mg/mL的昆侖雪菊油樹脂溶液中依次加入2.5 mL pH6.6的磷酸鹽緩沖液和2.5 mL 1% K3Fe(CN)6溶液,將混合溶液劇烈振蕩1 min,并在50 ℃下放置20 min,加入2.5 mL 10% TCA溶液,混合振蕩,從中吸取2.5 mL,加入等體積的蒸餾水和0.1% FeCl3溶液,振蕩混勻,靜置10 min,最后在700 nm波長處測定吸光度(A)。以無水乙酸作為空白對照,測吸光度A0?？偪寡趸芰梢訵A來表示:

WA=A-A0

式中:A0:不加樣品的吸光度;A:加入樣品的吸光度。

1.2.4 體內(nèi)抗氧化活性的測定

1.2.4.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 將健康雄性昆明種小鼠50只在飼養(yǎng)室適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后,按體重隨機(jī)分為5組,每組10只,即空白對照組NC、低劑量組LD(100 mg/(kg bw·d))、中劑量組MD(200 mg/(kg bw·d))、高劑量組HD(300 mg/(kg bw·d)),VC陽性對照組NC+(76 mg/(kg bw·d),空白對照組灌胃給予生理鹽水,其余各組按設(shè)定劑量給藥,灌胃體積為0.2 mL/(10 g bw),連續(xù)灌胃28 d。小鼠隔夜禁食,不限制飲水,在小鼠最后一次給藥5 h后摘眼球取血,離心(3000 r/min,15 min),取血清,并4 ℃密閉環(huán)境保存。小鼠處死后,進(jìn)行解剖取出臟器,立即稱重[18]。

1.2.4.2 抗氧化活性指標(biāo)的測定 小鼠處死后,立即在冰臺上取肝臟、腎臟,以冰水混合的生理鹽水洗去浮血,用濾紙吸干,用玻璃勻漿器制成組織勻漿,離心機(jī)離心(4 ℃,3000 r/min,10 min),分離上清液測定各項(xiàng)指標(biāo)。同時(shí)摘出胸腺及脾臟,用濾紙吸干臟器表面血污,在-80 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

樣品中丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活力、總抗氧化能力(T-AOC)采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒進(jìn)行測定;具體操作見試劑盒說明。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 昆侖雪菊油樹脂脂肪酸成分分析結(jié)果

由表1可知,昆侖雪菊油樹脂含有四種不飽和脂肪酸,占脂肪酸總量的53.28%。其中亞油酸相對含量達(dá)到22.81%,其次為花生二烯酸12.34%,亞麻酸10.84%和油酸7.29%。月桂酸和己酸的相對含量較少,分別為1.59%和2.11%。醫(yī)學(xué)研究表明,不飽和脂肪酸有明顯降低高密度脂蛋白血清膽固醇的作用,進(jìn)而減少高血壓、心臟病及中風(fēng)等的發(fā)病率[18]。亞麻酸對心血管疾病也有很好的防治作用[19],而亞油酸是人體必需的營養(yǎng)成分[20-21],這可能與昆侖雪菊的降血壓、降血脂作用有關(guān),其作用機(jī)理有待進(jìn)一步的研究。

表1 昆侖雪菊油樹脂脂肪酸GC-MS 分析結(jié)果Table 1 Results of GC-MS analysis offatty acids in the Kunlun chrysanthemum oleoresin

2.2 體外抗氧化活性分析

2.2.1 昆侖雪菊油樹脂清除·OH能力 由圖1可知,在所選濃度范圍內(nèi),隨著濃度的增大,昆侖雪菊油樹脂及TBHQ對·OH的清除能力均增強(qiáng)。說明昆侖雪菊油樹脂的·OH清除能力與濃度具有依賴性關(guān)系。當(dāng)昆侖雪菊油樹脂和TBHQ的濃度為1 mg/mL時(shí),昆侖雪菊油樹脂對·OH清除率為57.19%,而TBHQ對·OH的清除率則達(dá)到79.92%。昆侖雪菊油樹脂對·OH的清除率整體低于TBHQ,TBHQ對·OH清除能力的IC50值為(0.2468±0.0711) mg/mL,而昆侖雪菊油樹脂的IC50值為(0.7768±0.0675) mg/mL,低于TBHQ。這說明昆侖雪菊油樹脂對·OH具有一定的清除能力,但清除能力弱于TBHQ。

圖1 昆侖雪菊油樹脂對·OH的清除能力Fig.1 Scavenging capacity of theKunlun chrysanthemum oleoresin on hydroxyl radical

2.2.2 昆侖雪菊油樹脂清除DPPH·的能力 DPPH·是一種很穩(wěn)定的氮中心的自由基,作為一種穩(wěn)定的自由基,DPPH·可以捕獲其他的自由基。因此,對DPPH·的清除效果可以反映抗氧化劑的供氫能力[22]。由圖2可知,在所選濃度范圍內(nèi),隨著濃度的增大,昆侖雪菊油樹脂對DPPH·的清除能力增強(qiáng)。TBHQ對DPPH·的清除率一直保持平穩(wěn)的狀態(tài),但清除率都在80%以上。昆侖雪菊油樹脂對DPPH·的清除率從0.5 mg/mL開始,其增高的速率逐漸變大,當(dāng)昆侖雪菊油樹脂的濃度達(dá)到2 mg/mL時(shí),昆侖雪菊油樹脂對DPPH·的清除率為85.46%,而TBHQ對DPPH·的清除率為95.89%。昆侖雪菊油樹脂、TBHQ對DPPH·的IC50值分別為(0.8160±0.2219)、(0.0297±0.1248) mg/mL?？梢?昆侖雪菊油樹脂對DPPH·有一定的清除能力,但弱于TBHQ。

圖2 昆侖雪菊油樹脂對DPPH·的清除率Fig.2 Scavenging capacity of theKunlun chrysanthemum oleoresinon DPPH·

2.2.3 昆侖雪菊油樹脂總還原力的測定 由圖3可知,在0.02～0.5 mg/mL的濃度范圍內(nèi),隨著濃度的增加,TBHQ及昆侖雪菊油樹脂的總還原力均增強(qiáng)。TBHQ的總還原力一直處在上升的趨勢,而昆侖雪菊油樹脂隨著濃度的增大,其總還原力變化并不明顯。TBHQ的總抗氧化能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于昆侖雪菊油樹脂。

圖3 昆侖雪菊油樹脂總還原力Fig.3 Total reduction capacity ofthe Kunlun chrysanthemum oleoresin

2.3 體內(nèi)抗氧化活性分析

2.3.1 昆侖雪菊油樹脂對小鼠體重的影響 由表2可知,低劑量組LD、中劑量組MD、高劑量組HD灌胃前后小鼠體重增量分別為10.20、7.76、7.76 g,與空白對照組NC灌胃前后體重增量10.66 g相比,均沒有顯著性差異(P>0.05),說明昆侖雪菊油樹脂的灌胃劑量對小鼠體重影響不顯著。

表2 灌胃前后小鼠體重變化Table 2 Changes in body weight in mice before and after intragastric administration

2.3.2 小鼠血清SOD活力、MDA含量和總抗氧化能力 超氧化物在超氧化物歧化酶(SOD)的催化作用下轉(zhuǎn)化為氧氣和過氧化氫,能清除超氧陰離子自由基。丙二醛(MDA)在體內(nèi)是自然生成的,是氧化應(yīng)激的標(biāo)志物,MDA增加越多可以間接地反映機(jī)體細(xì)胞受到自由基攻擊的程度越大?？偪寡趸芰?T-AOC)反映了機(jī)體酶促反應(yīng)體系和非酶促反應(yīng)體系總的抗氧化水平[23-25]。因此,當(dāng)肝臟受到損傷時(shí),SOD活力、總抗氧化能力都有不同程度地降低,而MDA的含量有一定程度地升高。由表3可知,陽性對照組(VC)的SOD活力強(qiáng)于空白對照組,差異性極顯著(P<0.01),低劑量組的SOD活力與空白對照組相比沒有顯著性差異,而中、高劑量組差異性均顯著(P<0.05)。陽性對照組(VC)的MDA含量低于空白對照組,差異性極顯著(P<0.01),低劑量組血清中MDA含量低于空白對照組,中、高劑量組均達(dá)到極顯著水平(P<0.01)。陽性對照組(VC)的總抗氧化能力強(qiáng)于空白對照組,低、中和高劑量組的總抗氧化能力與空白對照組相比沒有顯著性差異,但均強(qiáng)于空白對照組。

表3 昆侖雪菊油樹脂對小鼠血清中SOD、MDA與T-AOC的影響結(jié)果Table 3 Effect of the Kunlun chrysanthemum oleoresin on SOD,MDA and T-AOC mouse serum

并且正常小鼠血清中SOD、總抗氧化能力的增強(qiáng)和MDA含量的降低均與昆侖雪菊油樹脂的濃度成依賴性關(guān)系。因此,昆侖雪菊油樹脂對小鼠血清中的SOD活力、總抗氧化能力有增強(qiáng)的作用,對MDA的含量有降低的作用,說明昆侖雪菊油樹脂具有抗氧化能力,且濃度越大,抗氧化能力越強(qiáng)。

2.3.3 小鼠肝臟SOD活力、MDA含量和總抗氧化能力 如表4所示,陽性對照組(VC)的SOD活力強(qiáng)于空白對照組,差異性顯著(P<0.05),低劑量組SOD活力與空白對照組相比沒有顯著性差異,而中劑量組SOD活力與空白對照組相比差異性顯著(P<0.05),高劑量組SOD活力與空白對照組相比差異性極顯著(P<0.01)。陽性對照組(VC)的MDA含量低于空白對照組,差異性顯著(P<0.05),低劑量組MDA含量低于空白對照組,差異不顯著,中、高劑量組均達(dá)到顯著水平(P<0.05)。陽性對照組(VC)的總抗氧化能力強(qiáng)于空白對照組,差異性極顯著(P<0.01),低、中劑量組的總抗氧化能力與空白對照組相比均沒有顯著差異,高劑量組的總抗氧化能力與空白對照組相比差異性顯著(P<0.05),且均強(qiáng)于空白對照組。并且正常小鼠肝臟中SOD活力、總抗氧化能力的增強(qiáng)和MDA含量的降低均與昆侖雪菊油樹脂的濃度成依賴性關(guān)系。因此,昆侖雪菊油樹脂對小鼠肝臟中SOD活力、總抗氧化能力有增強(qiáng)的作用,對MDA的含量有降低的作用,說明昆侖雪菊油樹脂具有抗氧化能力,且濃度越大,抗氧化能力越強(qiáng)。

表4 昆侖雪菊油樹脂對小鼠肝臟中SOD、MDA與T-AOC的影響結(jié)果Table 4 Effect of the Kunlun chrysanthemum oleoresin on SOD,MDA and T-AOC mouse liver

2.3.4 小鼠腎臟SOD活力、MDA含量和總抗氧化能力 由表5可知,陽性對照組(VC)的SOD活力高于空白對照組,差異性極顯著(P<0.01),低劑量組SOD活力與空白對照組相比沒有顯著性差異,而中劑量組差異性顯著(P<0.05),高劑量組差異性極顯著(P<0.01)。陽性對照組(VC)的MDA含量低于空白對照組,差異性不顯著。低、中和高劑量組的MDA含量與空白對照組相比沒有顯著差異,但含量均高于空白對照組。陽性對照組(VC)的總抗氧化能力強(qiáng)于空白對照組,差異性顯著(P<0.05),低劑量組總抗氧化能力低于空白對照組,但差異不顯著,中、高劑量組均達(dá)到顯著性水平(P<0.05)。并且正常小鼠腎臟中SOD活力、總抗氧化能力的增強(qiáng)和MDA含量的降低均與昆侖雪菊油樹脂的濃度成依賴性關(guān)系。因此,昆侖雪菊油樹脂對小鼠腎臟中SOD活力、總抗氧化能力有增強(qiáng)的作用,對MDA的含量有降低的作用,說明昆侖雪菊油樹脂具有抗氧化能力,且濃度越大,抗氧化能力越強(qiáng)。

表5 昆侖雪菊油樹脂對小鼠腎臟中SOD、MDA與T-AOC的影響結(jié)果Table 5 Effect of the Kunlun chrysanthemum oleoresin on SOD,MDA and T-AOC mouse kidney

3 結(jié)論

昆侖雪菊油樹脂脂肪酸成分分析結(jié)果表明:昆侖雪菊油樹脂共檢測出了12種脂肪酸,有4種不飽和脂肪酸,占脂肪酸總量的53.28%,其中亞油酸的相對含量達(dá)到22.81%、其次為花生二烯酸12.34%、亞麻酸10.84%和油酸7.29%。體外抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:昆侖雪菊油樹脂具有體外抗氧化活性,對·OH及DPPH·均有較強(qiáng)的清除能力,且呈劑量依賴性。昆侖雪菊油樹脂對·OH、DPPH·的IC50值分別為(0.7768±0.0675)、(0.8160±0.2219) mg/mL。體外抗氧化活性與特丁基對苯二酚(TBHQ)相比較弱。體內(nèi)抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:昆侖雪菊油樹脂可使血清、肝臟和腎臟實(shí)驗(yàn)組中SOD活力與空白對照組相比時(shí)明顯上升,其中高劑量組血清中的SOD活力差異性顯著(P<0.05),肝臟和腎臟中SOD活力差異性均極顯著(P<0.01);MDA含量與空白對照組相比下降,其中血清中的MDA含量差異性極顯著(P<0.01),肝臟中MDA含量差異性顯著(P<0.05);總抗氧化能力與空白對照組相比增強(qiáng),其中肝臟和腎臟中差異性均顯著(P<0.05)。因此,昆侖雪菊油樹脂可以增強(qiáng)受試動(dòng)物的抗氧化能力,具有良好的體內(nèi)抗氧化作用。